Aquaporin 3與哺乳動物胚胎著床相關性的研究.pdf

1、目的：
　　胚泡著床是生殖過程中的關鍵環(huán)節(jié)和限速步驟，這一過程包括胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細胞的識別、定位、黏附，進而穿過基底膜植入到子宮內(nèi)膜。子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)受雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progestin，P4)、細胞因子和生長因子等許多因素的共同調(diào)節(jié)，使胚泡與子宮雙方發(fā)生一系列同步的變化，活化的胚胎只有在子宮內(nèi)膜進入“著床窗口期”才能著床，此時子宮腔內(nèi)的液體減少，使游離的胚胎與子宮內(nèi)膜充分接觸，有利于胚胎黏附在子宮內(nèi)

2、膜上。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)在細胞膜上廣泛表達，完成對各種上皮和內(nèi)皮組織的液體轉(zhuǎn)運以維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定外，并參與血管生成、腫瘤細胞遷移與侵襲、組織損傷修復、維持細胞穩(wěn)態(tài)和免疫功能等多種重要生命活動。有研究表明胚胎著床過程中子宮內(nèi)膜AQPs表達存在變化，但AQPs對胚胎著床調(diào)控機制并不明確。本文檢測Aquaporin3(AQP3)在小鼠不同動情周期和自然早孕小鼠子宮內(nèi)膜的表達及分布情況，并分析AQP3在人不同時期子宮

3、內(nèi)膜及不同接受態(tài)子宮內(nèi)膜細胞中的表達，探討孕、雌激素對AQP3表達的影響，以及調(diào)控AQP3表達對胚胎與不同接受狀態(tài)子宮內(nèi)膜黏附、侵襲和遷移影響。明確其在胚胎著床過程中的功能及作用機制，對生殖疾病治療以及提高輔助生殖成功率具有一定意義。
　　方法：
　　(一)水通道蛋白3在不同時期小鼠子宮內(nèi)膜及蛻膜化組織中表達
　　1.用陰道涂片的方法確定小鼠的動情周期;將不同動情周期小鼠的子宮解剖組織用37℃PBS清洗后，拍照觀察子宮

4、大小充水情況;用免疫組化、Western blot及Real-time PCR技術，檢測小鼠不同動情周期中AQP3表達與定位情況;
　　2.用免疫組化檢測小鼠妊娠D1和D5，AQP3分布及表達情況，并用Western blot及Real-time PCR分析其表達情況;
　　3.小鼠妊娠D8天，用免疫組化的方法分析小鼠著床位點和非著床位點的子宮內(nèi)膜與蛻膜組織中AQP3的分布及表達情況;
　　(二)AQP3隨月經(jīng)周期變化

5、及在胚胎著床中的機制研究
　　1.通過免疫組化方法檢測AQP3在不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達及分布;
　　2.通過Western blot、Real-time PCR及免疫熒光方法檢測AQP3在不同接受態(tài)子宮內(nèi)膜細胞中的表達與分布情況;
　　3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的AQP3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人子宮內(nèi)膜細胞系HEC-1A細胞(低接受態(tài)子宮內(nèi)膜上皮細胞)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的AQP3干擾質(zhì)粒(AQP3-siRNA)轉(zhuǎn)

6、染到人子宮內(nèi)膜細胞系RL95-2細胞(高接受態(tài)子宮內(nèi)膜上皮細胞);
　　4.通過Transwell小室、細胞劃痕檢測AQP3對子宮內(nèi)膜細胞的侵襲和遷移的影響;用JAR細胞模擬胚胎，通過黏附實驗檢測AQP3對子宮內(nèi)膜細胞與胚胎細胞之間黏附情況;
　　5.通過Western blot、Real-time PCR檢測用不同濃度孕激素、雌激素和卵巢類固醇類激素對AQP3基因及蛋白表達的影響;
　　6.通過Western blo

7、t檢測，E2P4通過AQP3介導RL95-2細胞發(fā)生EMT;通過細胞劃痕和Transwell實驗分析卵巢類固醇激素通過AQP3介導RL95-2細胞的遷移和侵襲;
　　7.通過免疫共沉淀和免疫熒光實驗檢測AQP3與Ezrin之間的相互作用;通過Western blot、Real-time PCR檢測，卵巢類固醇激素和AQP3-siRNA作用RL95-2細胞后，檢測AQP3和Ezrin之間調(diào)控關系;
　　8.鬼筆環(huán)肽染色，通過熒

8、光檢測，AQP3與細胞骨架之間的調(diào)控關系;通過免疫熒光檢測AQP3與Ezrin之間的調(diào)控關系。
　　結果：
　　(一)水通道蛋白3在不同時期小鼠子宮內(nèi)膜及蛻膜化組織中表達
　　1.AQP3在小鼠動情周期過程中，主要表達在子宮內(nèi)膜基質(zhì)中，子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞無表達。主要表達在小鼠動情前期和動情期，后期最少;在小鼠的動情前期和動情期子宮腫大充水且子宮腔隙大，后期和間期子宮細長，基本無空隙，后期尤為突出;
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9、.AQP3主要表達在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)中，在子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮無表達，在妊娠小鼠D5的AQP3的表達量比妊娠D1天的表達量高。并且在小鼠妊娠D5，圍繞子宮內(nèi)膜腔的基質(zhì)中表達量比子宮壁周圍表達量高;
　　3.在妊娠小鼠D8，AQP3在著床位點的子宮內(nèi)膜中及蛻膜組織無表達，在非著床位點的子宮內(nèi)膜和肌層有較高表達。
　　(二)AQP3隨月經(jīng)周期變化及在胚胎著床中的機制研究
　　1.AQP3主要表達在人月經(jīng)周期的分泌中期和分

10、泌晚期的腔上皮和腺上皮細胞的基底側(cè)，分泌中期表達量出現(xiàn)峰值;
　　2.AQP3表達量在RL95-2細胞中的表達量高于HEC-1A細胞;
　　3.通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)HEC-1A細胞的AQP3的表達;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)RL95-2細胞的AQP3的表達
　　4.AQP3促進細胞的遷移和侵襲，對黏附無影響;
　　5.孕激素能夠上調(diào)AQP3的表達，低劑量的雌激素能上調(diào)AQP3的表達，高劑量的雌激素無作用甚至能抑制AQP3的表達，E

11、2P4比同劑量的孕激素、雌激素單獨作用，對AQP3表達的促進作用更為明顯;
　　6.卵巢類固醇激素通過AQP3介導子宮內(nèi)膜細胞(RL95-2細胞)發(fā)生EMT，促進細胞的遷移和侵襲;
　　7.通過免疫共沉淀和免疫熒光檢測到AQP3與Ezrin之間存在相互作用;AQP3與Ezrin之間不存在表達量上的調(diào)控關系;
　　8.卵巢類固醇激素通過AQP3促進細胞骨架中絲狀偽足、板狀偽足的形成和應力纖維的重構;卵巢類固醇激素通過AQ

12、P3影響Ezrin在細胞中的分布。
　　結論：
　　(一)水通道蛋白3在不同時期小鼠子宮內(nèi)膜及蛻膜化組織中表達
　　1.AQP3能夠負責子宮腔水分子的雙向轉(zhuǎn)運;
　　2.AQP3在著床窗口期高表達，可能對于胚胎著床起正向調(diào)控作用;
　　3.推斷AQP3在蛻膜化過程無作用，但可以促進子宮鎖的形成。
　　(二)AQP3隨月經(jīng)周期變化及在胚胎著床中的機制研究
　　1.AQP3在著床窗口期的人子宮內(nèi)膜中

13、表達出現(xiàn)峰值，并且在高接受態(tài)子宮內(nèi)膜細胞系RL95-2中表達高于低接受態(tài)子宮內(nèi)膜細胞系HEC-1A，提示AQP3可能作為子宮內(nèi)膜接受態(tài)標志物，并且對于胚胎著床過程起到一定作用;
　　2.AQP3通過影響子宮內(nèi)膜細胞的侵襲和遷移促進胚胎著床的順利進行，對其黏附過程無明顯作用;
　　3.雌、孕激素聯(lián)合作用于子宮內(nèi)膜細胞促進AQP3的表達;
　　4.E2P4通過AQP3介導的EMT促進子宮內(nèi)膜細胞的侵襲和遷移;
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