SCF-c-kit信號途徑通過GRK6轉激活CXCR4并調控心臟干細胞的遷移.pdf

1、大量的研究表明，在正常成年人和鼠心臟內含有原始的、未分化的Lin(-) c-kit(+)干細胞，它們分布廣泛并維持著心臟內部的穩(wěn)態(tài)，被認為是心臟干細胞(Cardiac stem cell, CSC)。我們以往的研究發(fā)現，在大鼠心肌梗死模型中，受損心肌細胞高度表達干細胞因子(stem cell factor, SCF)，SCF及其位于 CSC表面的受體 c-kit構成的SCF/c-kit信號介導了 CSC向梗死區(qū)的遷移并改善了心功能。在實

2、驗過程中，我們試圖通過阻斷 SCF/c-kit的下游信號 p38 MAPK來阻斷CSC的遷移，但出人意料的是，阻斷 p38 MAPK并未能完全阻斷 CSC的遷移，提示可能還有其他信號因子發(fā)揮了調控CSC遷移的作用。CSC除了表達c-kit之外，還表達另外一個與趨化相關的受體 CXCR4。有報道稱，CXCR4在沒有其配體基質衍生因子1（SDF-1）存在的情況下，仍然可以被其它的受體信號轉激活，從而發(fā)揮作用。但是 SCF/c-kit信號是否

3、能夠轉激活 CXCR4，從而影響細胞的遷移呢？這一點并不清楚。本研究旨在探討CXCR4轉激活在SCF/c-kit誘導的CSC遷移中的作用及機制，論文分為3個部分：
　　第一部分：心臟干細胞的培養(yǎng)分離和鑒定。利用原代組織塊培養(yǎng)的技術，從C57BL/6小鼠心臟中分離出 c-kit陽性的心臟干細胞，并在體外予以擴增培養(yǎng)。通過流式細胞儀和免疫熒光的檢測，CSC為c-kit和CXCR4雙陽性細胞，并且長期的體外培養(yǎng)也基本不影響c-kit和C

4、XCR4的表達，說明可以用于后續(xù)的實驗。另外，分離出的CSC在體外用地塞米松進行誘導培養(yǎng)，CSC可以成功的向心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞分化，說明CSC具有多向分化的潛能。
　　第二部分：CXCR4的轉激活在SCF/c-kit信號誘導的CSC遷移中的作用。首先，我們用SCF刺激CSC，通過Transwell和Western Blotting的方法來觀察SCF/c-kit信號激活后對CSC遷移及與遷移相關MAPK信號的影響。然后用

5、CXCR4的siRNA沉默CSC中CXCR4的表達，觀察CSC的遷移在沉默CXCR4之后的改變。已只CXCR4激活后可引起起絲氨酸339位點的磷酸化，于是，我們用SCF刺激CSC，觀察SCF/c-kit信號是否能夠轉激活CXCR4，并引起其絲氨酸339位點磷酸化的變化。接下來，我們構建CXCR4絲氨酸339位點缺失突變的模型，研究CXCR4絲氨酸339位點的缺失對SCF/c-kit信號的影響。結果顯示：SCF能夠誘導CSC的遷移以及增強

6、CXCR4絲氨酸339位點、p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。沉默CXCR4之后后，SCF/c-kit信號引起的CSC的遷移、p38 MAPK及ERK1/2的磷酸化也隨之降低。在HEK293細胞系中，CXCR4絲氨酸339位點的缺失也會影響SCF/c-kit信號誘導的細胞遷移。
　　第三部分：G protein-coupled receptor kinase6（G蛋白受體激酶6，GRK6）調控CXCR4絲氨酸339位點的磷酸

7、化并影響SCF/c-kit信號介導的CSC的遷移。根據報道，GRK6在 CXCR4磷酸化的過程中起到了重要的作用，所以我們用 GRK6的質?；騭iRNA使CSC中GRK6的表達量升高或降低，來觀察其在SCF/c-kit信號中是否會影響CXCR4絲氨酸339位點的磷酸化以及細胞的遷移。之后我們在體內進行實驗驗證，在小鼠的心肌梗死模型中，我們沉默GRK6之后觀察CSC向梗死區(qū)遷移量的改變。結果顯示：沉默GRK6減弱SCF/c-kit誘導的C

8、XCR4絲氨酸的磷酸化、CSC的遷移以及MAPK的激活；而高表達GRK6則是相反的結果。另外，在小鼠心肌梗死模型中，沉默GRK6也影響CSC向梗死區(qū)遷移的能力。
　　綜上所述，c-kit和CXCR4在CSC中存在信號和功能上的交流。SCF/c-kit信號通過GRK6能夠轉激活CXCR4，并且誘導其絲氨酸339位點的磷酸化，共同調節(jié)CSC的遷移和下游信號MAPK的激活。c-kit和CXCR4這兩個受體信號通路都和CSC參與心肌修復有