蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆與表達(dá)及卵巢組織差異表達(dá)基因研究.pdf

1、綿羊的繁殖性狀一般分為受胎率、多胎率及羔羊存活率三類性狀，繁殖性能的高低直接關(guān)系到養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)成本和生產(chǎn)效率，具有重人的經(jīng)濟(jì)意義。蒙古羊是我國最古老的地方綿羊品種之一，烏珠穆沁系蒙古羊是在當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)長期選育形成的一個優(yōu)良類群，幾有許多優(yōu)良特性，主要以抗病力強(qiáng)、產(chǎn)肉率高和繁殖性能高而聞名。為了揭示蒙古羊高繁殖性能，使蒙古羊這一寶貴資源能得到有效利用，本研究以烏珠穆沁系蒙古羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，前先以BMPR-IB和FSHβ基因作為蒙古羊

2、高繁殖力候選基岡，對其進(jìn)行了克隆及序列分析，并采用實(shí)時熒光定JPCR (RQ-PCR)的相對定量方法對BIUPR-IB和FSH口基因在單羔蒙古羊非發(fā)情期、發(fā)情期及產(chǎn)雙羔蒙古羊懷孕后期的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦和垂體組織進(jìn)行了差異表達(dá)研究；其次采用抑制性淌減雜交技術(shù)( SSH)塒經(jīng)產(chǎn)譯、雙羔蒙古羊的卵巢組織差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選并采用電子克隆加RT-PCR方法對部分差異表達(dá)基因進(jìn)行了克隆和驗(yàn)證。通過以上研究，為提高我國肉用綿羊繁殖力及加

3、快肉羊新品種選育提供了重要的理論依據(jù)，并獲得以下主要研究結(jié)果：
　　 (l)采用RT-PCR方法分別從蒙古羊卵巢組織中擴(kuò)增出BMPR-IB，F(xiàn)SHβ基因的cDNA序列。蒙古羊BIWPR-IB基因全長1567bp，包括完整的1509bp開放讀碼框（ORF），共編碼502個氨基酸。通過對單、多胎蒙古羊BMPR-IB基岡測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在單、多胎蒙古羊BMPR-IB基因編碼區(qū)第746位和第1113位堿基相一致，分別為“A”和“C”，

4、并沒有發(fā)生同多胎Booroola羊相同的A—G突變和C-A突變。蒙古羊FSHβ基岡全長1021bp，包括完整的390bp ORF，共編碼129個氨基酸。
　　 (2)采用相對定量的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法建立了蒙古β-Actin、BMPR-IB和FSHβ基因的RQ-PCR反應(yīng)體系。以非發(fā)情期單羔蒙古羊的卵巢組織定量結(jié)果為對照，計算得到FSHβ基因在單羔蒙古羊發(fā)情期下丘腦組織中表達(dá)量最高，在發(fā)情期的輸卵管組織中表達(dá)量最低；BMPR-IB基岡在

5、單羔蒙古羊發(fā)情期卵巢組織中表達(dá)量最高，在發(fā)情期的子宮組織中表達(dá)量最低。在卵巢組織中，F(xiàn)SHβ基因在發(fā)情期卵巢組織中的表達(dá)址是非發(fā)情期的1.31倍，雙羔羊是單羔羊的0.70倍；BMPR-IB基岡在發(fā)情期卵巢組織中的表達(dá)量是非發(fā)情期的2.65倍，雙羔羊是單羔羊的2.16倍。證明BMPR-IB基因是蒙古羊多胎主要候選基因，F(xiàn)SHβ基因雖然在綿羊繁殖過程中具有重要的作用，但并非蒙古羊多胎主效基因，可能與多胎性狀的主基因或QTL相連鎖。
　

6、　 (3)采用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了單、雙羔蒙古羊卵巢組織的正、反向消減cDNA文庫，并從兩個消減cDNA質(zhì)粒文庫中篩選得到768個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布于150～lOOObp之間。結(jié)合斑點(diǎn)雜交技術(shù)獲得到差異克降373個，通過測序和同源性檢索獲得已知基因序列185條，10條己知的差異表達(dá)EST和4條未知的EST序列。
　　 (4)對差異表達(dá)基因功能分析表明，本實(shí)驗(yàn)所獲得的基因主要由以下幾大類組成：機(jī)體和細(xì)胞防御、免疫

7、類14個，代謝類53個，物質(zhì)運(yùn)輸類20個，核酸修飾類12個，細(xì)胞發(fā)育類18個，信號傳導(dǎo)類12個，細(xì)胞結(jié)構(gòu)類9個，未分類47個，其中代謝類基因占據(jù)了最大部分占28 65％。將這些差異表達(dá)基因和已報道的與繁殖性狀相關(guān)的基岡比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過初步篩選得到12個差異表達(dá)基因與己報道的繁殖性狀相關(guān)基因相一致，這些基因分別為ITGB1、BMP6、WHC-I、ACIRLI、IGFBP5、SPONI、ABP5、ADAMTS1、FAM46A、THYI、ARP

8、3和Id3基因。
　　 (5)分別以SSH獲得的差異表達(dá)ADAMTS1和Id3基因序列片段為種子序列在綿羊的EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastn同源性檢索，得到相應(yīng)的UniGene編號分別為Oar．7453和Oar．5068，經(jīng)過序列拼接分別得到2418bp和1099bp的蒙古羊ADAMTSI、Id3基因電子克降cDNA序列。采用RT-PCR方法實(shí)驗(yàn)克降得到2420bp的蒙古羊ADAMTSI基因序列和1045bp的蒙古羊Id3基因序列