肽類化合物對H37Ra抑制的優(yōu)化篩選.pdf

1、長春工業(yè)大學碩士論文摘要結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染疾病，現(xiàn)有研究表明結核桿菌被巨噬細胞吞噬后，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài)，通過乙醛酸循環(huán)獲取能量，至今尚未在人等哺乳動物中(小鼠除外)發(fā)現(xiàn)此循環(huán)。現(xiàn)有藥物會隨著患者免疫力下降或者停藥，而重新致病。因此研究新型抗結核藥物迫在眉睫。異檸檬酸裂解酶(ICL)是結核桿菌在人體內(nèi)處于持續(xù)感染狀態(tài)時乙醛酸支路代謝中的關鍵限速酶，是其潛伏狀態(tài)下生存所必需的。因此，本文以ICL為靶點研發(fā)抗結核藥物。本研

2、究利用Fmoc固相合成法合成多肽抑制劑，HPLC色譜儀純化合成的多肽并進行質(zhì)譜檢測。通過H37Ra抑菌實驗，確定不同培養(yǎng)基條件下多肽的抑菌效果，并測定其最小抑菌濃度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)。加入不同濃度Vc，比較抑菌效果，進一步優(yōu)化篩選多肽抑制劑。本研究共篩選得到4條多肽且均有抑菌效果，并與劑量相關。結果表明，濃度為800～1500兒g／mL時，各組多肽均有抑菌作用。濃度為500pg／mL

3、時，正常培養(yǎng)基中只有一種肽有抑菌作用，而限制碳源培養(yǎng)基中均不能抑菌。篩選出一個多肽(2號)抑菌效果最好，在正常培養(yǎng)基中MIC為200pg／mL，限制碳源中為500tg／mL。根據(jù)MIC結果，抑菌實驗檢測到多肽、利福平和異煙肼的抑菌效果與劑量相關。篩選2號肽通過MTT比色法進行細胞毒性試驗，細胞選用具有吞噬作用的THP1細胞。結果表明，肽濃度增大為20mg／mL時，MTT檢測細胞毒性較小。采用20mg／mL進行胞內(nèi)實驗，進一步檢測其生物活

4、性。H37Ra感染THP1，篩選肽對H37Ra在巨噬細胞內(nèi)生存能力的測定結果表明，細菌已經(jīng)被細胞有效吞噬。菌落計數(shù)顯示，H37Ra感染nP1后細菌可在胞內(nèi)繁殖，且隨感染時間延長數(shù)量增加。當肽為20mg／mL時，4d、7d菌落數(shù)均下降，細菌生長受到明顯抑制。這說明在較低的濃度下，2號肽表現(xiàn)出對胞內(nèi)細菌的抑制作用。本研究證明從生物信息學出發(fā)，通過篩選肽MIC、肽最小細胞毒性、篩選肽胞內(nèi)抑菌一系列操作優(yōu)化實驗確定有效的多肽。試驗結果為進一步探

5、索結核桿菌抑制劑奠定了良好的基礎。關鍵詞：異檸檬酸裂解酶肽類抑制劑MIC細胞毒性巨噬細胞長春工業(yè)大學碩士論文studyshowedthatthepeptideofNo2couldinhibitthegrowthofH37RaintracellularatalowerconcentrationBasedOnbioinformatics，peptideinhibitorswerescreenedandoptimizatedwhichtarg