微溝槽圖形結構硅橡膠研發(fā)及生物相容性初步研究.pdf

1、目的：
　　在課題組前期研究中，采用羥基磷灰石進行表面仿生涂層、β-磷酸三鈣和硅橡膠進行共混交聯(lián)復合，以及以人體碳元素(C)注入等方式改變硅橡膠表面某些性能，以此改善人成纖維細胞在此表面的粘附、增殖能力等。同時也發(fā)現(xiàn)，幾種改性材料的表面形貌均較普通硅橡膠發(fā)生了變化，提示我們硅橡膠的表面形貌影響材料的細胞相容性。為進一步研究材料表面的微形貌對其理化性能以及細胞相容性的影響，本實驗通過在表面設計微溝槽圖形結構，以此探究表面性能以及細胞

2、增殖、粘附等細胞行為，同時建立大鼠背部軟組織缺損動物模型，對改性前后的硅橡膠進行植入應用觀察，以期能研制出具有良好軟組織填充材料提供理論依據(jù)。
　　利用具有微溝槽圖形的方形母版，采用澆灌的方法成功制作表面具有微溝槽圖形的硅橡膠改性材料，同時統(tǒng)一劑量的碳離子注入改性，并選用掃描電鏡（ScanningElectron Microscope，SEM）、原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)技術觀察改性前后

3、材料表面的微觀形貌的變化，X射線光電子能譜（X-ray photoelectronspectroscopy，XPS），水接觸角等技術衡量改性前后材料的表面物理化學性能。同時采用了一系列體外實驗研究改性前后的材料細胞相容性，以及體內(nèi)實驗分析以及評價改性前后材料的組織相容性，以期能制備出一種符合臨床需要，且副作用相對較小的新型軟組織填充材料。
　　方法：
　　本實驗分四部分
　　第一部分:制備母版和SR、P-SR的制備以及

4、碳離子注入處理表面
　　1.兩種硅橡膠的制備
　　a.具有微溝槽圖形結構的硅橡膠制備
　　具有微溝槽圖形的12cm×12cm方形玻璃母版（中國電子科技集團公司第二十六研究所提供），鐵質(zhì)外框由重慶銀利來模具有限公司制作。將室溫硫化雙組份醫(yī)用液態(tài)硅硅橡膠（成都晨光化工研究院）A、B組分按1∶1混勻后澆灌到母板上，室溫下硫化3-4h成膜，取下具有微圖形結構的硅橡膠(P-SR)待下一步實驗。
　　b.光滑的硅橡膠制備

5、r>　　將同種硅橡膠原材料相同比例混勻后，澆灌到超聲鏡面的模板上(自制)，待其室溫完全硫化后選擇平整光滑、無殘缺的硅膠片作后續(xù)實驗。
　　2.將SR、P-SR放入多功能離子注入機里進行碳離子注入，劑量為1×1016 ions/cm2，形成C-SR、PC-SR。本步驟由西南核工業(yè)物理研究所完成。
　　3.實驗分組:為普通硅橡膠SR，具有微溝槽圖形的硅橡膠P-SR，碳硅橡膠C-SR，碳離子注入后的微溝槽圖形硅橡膠PC-SR。

6、r>　　第二部分:各組硅橡膠微形貌的觀察以及理化性能的檢測
　　樣本表面的微觀結構布局能夠通過SEM、AFM技術手段觀測。評價改性前后硅橡膠表面的理化性能則是通過XPS、水接觸角分析。
　　第三部分:材料的細胞相容性實驗
　　1.細胞的準備:體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人真皮成纖維細胞，將其接種于各組實驗樣本表面，以待后續(xù)實驗。
　　2.實驗分組情況:SR組、P-SR組、P-SR組、PC-SR組。在各組材料表面上接種人真皮成纖

7、維細胞。
　　3.各組材料表面細胞的細胞骨架(actin)熒光表達情況由激光共聚焦顯微鏡可觀測材料上細胞的骨架熒光表達情形，間接了解材料表面的細胞形態(tài)以及排列情況;并采用CCK-8法檢測細胞在各組改性硅橡膠表面1天、2天、4天、6天的增殖情況，采用SSPS17.0進行相關的統(tǒng)計學評價。
　　4.應用Western Blot檢測分析各組材料上人真皮成纖維細胞粘附相關蛋白Talin、Zyxin、Vinculin的表達情況，并對其

8、進行生物學評價。
　　第四部分:材料的組織相容性實驗
　　1.建立大鼠背部軟組織缺損動物模型
　　a.購置160-200g雌性成年SD大鼠3只;
　　b.將各組改性前后的硅橡膠裁剪成1cm×1cm大小，消毒備用;
　　c.3％戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，麻醉顯效后，常規(guī)去毛、消毒鋪巾，背部近背脊兩側做6cm×6cm大小術區(qū)，做0.5cm縱形切口至皮下，鈍性分離出約1.5cm×1.5cm的潛行腔隙，將備用的硅橡膠

9、放置腔隙，切口間斷縫合、消毒;
　　d.埋置時間7天、15天、1月;
　　2.根據(jù)埋置時間，適時取材，觀察大體形態(tài)以及放置液氮灌里存放;
　　3.采用HE、Masson、免疫組化等實驗技術觀察組織-材料反應。
　　結果：
　　1.成功制備出具有微溝槽圖形的P-SR，以及光滑的SR，并采用多功能離子注入機在統(tǒng)一條件下進行碳離子注入，制備出具有微溝槽圖形的碳硅橡膠PC-SR，以及碳硅橡膠C-SR。
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10、.使用SEM觀察改性前后硅橡膠的表面形貌，未發(fā)現(xiàn)微觀形貌有明顯差異。而進一步采用AFM觀察，可見普通SR表面光滑;P-SR上可見溝槽整齊的微溝槽圖形;進行碳離子注入后的C-SR呈凸凹不平的丘陵地貌，“突出”與“凹陷”形貌各異，并無統(tǒng)一性;而PC-SR見在整齊的微溝槽圖形間可見凹凸形貌。
　　3.XPS分析顯示:注入C后，C-SR、PC-SR與SR、P-SR比較，C、Si、O三種元素的峰值發(fā)生改變。水接觸角分析得到:微溝槽增加了硅橡

11、膠表面的疏水性;而碳離子注入則增加其表面的親水性。
　　4.通過激光共聚焦顯微鏡觀察各組材料表面人真皮成纖維細胞的骨架情況，間接查看出材料表面形貌學對細胞形態(tài)的影響。人真皮成纖維細胞在SR的生長情況較差，細胞稀疏，排列無序;P-SR組細胞生長情況較SR類似，但細胞梭形較SR明顯，排列有序。C-SR組細胞生長情況優(yōu)于SR，且細胞形態(tài)鋪展，面積增大;PC-SR組，細胞生長優(yōu)于SR和P-SR,略差于C-SR，細胞鋪展情況優(yōu)于SR和P-S

12、R，但較C-SR差，細胞的排列較C-SR組相比有序。掃描電鏡觀察各組材料表面人真皮成纖維細胞的細胞形態(tài)，觀察到材料表面形貌可影響細胞形態(tài)以及排列情況。人真皮成纖維細胞在SR排列無序;P-SR組細胞生長情況較SR類似，排列有序。C-SR組細胞鋪展面積增大;PC-SR組細胞的排列較C-SR組相比有序。
　　5.各種硅橡膠表面對細胞增殖的影響由CCK-8法測定，實驗結果顯示:C-SR組和PC-SR組分別與SR組和P-SR組相比，細胞增殖

13、明顯提高（*P＜0.05），其中C-SR組細胞增殖能力最強，PC-SR稍次之，但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。細胞粘附實驗結果顯示:各組硅橡膠表面對細胞粘附的影響和細胞的增殖趨勢基本一致。
　　6.Western blot檢測各種材料表面細胞粘附相關蛋白(Talin、Zyxin、Vinculin)的表達情況，發(fā)現(xiàn)改性后的硅橡膠蛋白表達高于普通硅橡膠，但C-SR與PC-SR之間的蛋白表達情況與細胞增殖情況一致。
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14、.成功建立大鼠背部軟組織缺損動物模型。
　　8.HE染色可見急性期（7天），各組材料炎性細胞浸潤明顯，各組細胞數(shù)量差距不明顯;亞急性期（15天）以及慢性期（30天）各組材料周圍趨化的炎性細胞數(shù)量漸少，且經(jīng)過碳離子注入后的硅橡膠(C-SR、PC-SR)周圍的炎性反應明顯低于未注入組(SR、P-SR);表面經(jīng)過微圖案化處理后的硅橡膠周圍的炎性細胞數(shù)量也較對照組少(P-SR＜SR; PC-SR＜C-SR)，說明微溝槽圖形化的碳硅橡膠相比

15、普通硅橡膠，對機體炎性刺激較小。
　　9.Masson染色以及α-SMA以及Vimentin免疫組化均可表達材料周圍包膜主要成分膠原成分，其結果顯示植入后前期，材料周圍的纖維化不甚明顯，而后期包膜厚度增加，而同一時期比較，經(jīng)過碳離子處理的硅橡膠(C-SR、PC-SR)周圍的包膜厚度以及膠原沉積程度明顯低于未注入組(SR、P-SR);表面經(jīng)過微圖案化處理后的硅橡膠周圍的膠原沉積程度也較對照組少(P-SR＜SR; PC-SR＜C-SR

16、)，以此可推測經(jīng)過微溝槽圖形化與碳離子注入的硅橡膠包膜厚度較薄，膠原沉積較少，材料與機體組織具有更好的契合度。
　　結論：
　　1.微溝槽結構的碳硅橡膠制作方法簡便，易于操作。
　　2.微溝槽結構碳硅橡膠表面理化性能穩(wěn)定，適度增加表面疏水性。
　　3.PC-SR可增加粘附以及增殖能力，且表面微結構促進細胞有序排列，提示材料表面微圖形對細胞功能具有顯著影響，為設計出具有臨床需求的植入材料提供理論依據(jù)。
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