一株產蛋白酶海洋菌的鑒定、產酶條件優(yōu)化和酶的性質研究.pdf

1、微生物蛋白酶是一種在洗滌、皮革、銀洗、醫(yī)藥、食品、飼料、化工和廢處理上都有極強大工業(yè)應用潛力的酶。本論文以實驗室從南海海域海水中分離得到的一株產蛋白酶的海洋微生物NSB-2為研究對象，對該菌種進行了鑒定、產酶條件優(yōu)化;以初純的酶液為研究對象，進行了酶學性質和穩(wěn)定性研究，并開展了液體酶保護劑的研究，以期為今后的開發(fā)和應用奠定基礎。
　　1、通過對菌株NSB-2進行顯微鏡和電鏡掃描形態(tài)觀察，生理生化分析和16SrDNA基因序列測定及同

2、源性分析，初步確定產蛋白酶菌株NSB-2為芽孢桿菌屬，GenBank登陸號為JX240363;該菌為革蘭氏陽性細菌，菌體長約2-3微米，適宜的生長pH范圍為5.0-11.0，生長溫度范圍較寬，在4℃-50℃環(huán)境下均可良好生長。
　　2、采用單因素和中心組合試驗對菌株NSB-2產蛋白酶的培養(yǎng)基和搖瓶條件進行了優(yōu)化。首先通過單因素實驗篩選最佳碳氮源及其最適濃度，并依次優(yōu)化初始pH、接種量、種齡、裝液量、發(fā)酵溫度、轉速。研究結果表明:當

3、酶活達到最高值時，各單因素的值分別為麩皮50 g/L、豆面40 g/L，氯化鈉5g/L，硫酸鎂1.5g/L，接種量4％，起始pH7.0，裝液量40mL，培養(yǎng)溫度30℃，轉速180rpm;利用中心組合實驗(CCD)對發(fā)酵培養(yǎng)基的3個主要成分進行組合設計，采用Design Expert8.05軟件分析獲得了主要因素的最優(yōu)條件，即麩皮濃度53.2g/L，豆面濃度38.2 g/L、氯化鈉3.0 g/L;以優(yōu)化的最優(yōu)條件為參數，預測最高酶活力為6

4、466.8U/ml，試驗獲得酶活可達6346 U/ml，其實驗值與預測值基本相符，說明預測模型可應用于蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。相比最初產酶活性提高了近7倍
　　3、采用硫酸銨沉淀和膜分離進行了酶的初步分離純化，對初步純化的酶液進行了酶學性質的研究。結果表明:該酶可被蛋白酶抑制劑PMSF嚴重抑制，因此該酶隸屬于絲氨酸蛋白酶家族;其最適作用溫度為50℃，最適作用pH為10.0;該酶在40℃、pH10.0條件下穩(wěn)定性很好，4h幾乎沒有損失

5、;Ca2+、Mg2+、Ba2+、K+、Co2+對酶活性沒有影響，Al3+、Li+、Fe2+、EDTA能夠一定程度的抑制蛋白酶的酶活，Fe3+、Zn2+、Ag+、Cu2+會嚴重影響該蛋白酶的活性;EDTA和常用表面活性劑SDS、TritonX-100、吐溫40和吐溫60對酶活性影響不大，顯示該酶作為洗滌添加酶具有良好的應用前景。
　　4、開展了糖類、多元醇和金屬離子對該酶穩(wěn)定性保護作用的研究，結果顯示，在試驗范圍內，對酶的熱穩(wěn)定性有