山葡萄成熟果皮cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及EST分析.pdf

1、山葡萄是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料,用山葡萄釀造的葡萄酒口味獨(dú)特,深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。為了研究山葡萄成熟過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)情況,鑒定出與山葡萄成熟、香氣物質(zhì)形成、花色苷合成及抗病相關(guān)的基因,進(jìn)行了以下研究:
　　 通過(guò)三種RNA提取方法提取山葡萄成熟果皮的總RNA,其中改良的CTAB法能分離出高質(zhì)量的RNA,可以用于下一步的分子生物學(xué)研究。以山葡萄成熟果皮為材料,采用Creator SMARTTM cDNA Librar

2、y Construction技術(shù)構(gòu)建了cDNA文庫(kù)。經(jīng)鑒定,文庫(kù)的庫(kù)容量為1.001x106,重組率為94％,插入片段在0.25～2.0 kb之間。經(jīng)隨機(jī)測(cè)序,獲得935條有效EST,聚類拼接后得到636條單基因簇(unigenes),包括108個(gè)重疊群(contigs)和528個(gè)單拷貝(singlets)。這些數(shù)據(jù)為今后山葡萄功能基因的分離克隆和功能基因組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 EST分析結(jié)果表明,文庫(kù)中未知功能基因(fu

3、nction unknown)占17.92％,控制代謝(metabolism)的基因?yàn)?0.81％,與細(xì)胞救援與防御(cell rescue,defence)相關(guān)的基因?yàn)?.15％,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)基因?yàn)?.68％,能量(energy)相關(guān)基因?yàn)?.61％,蛋白合成(protein synthesis)相關(guān)基因?yàn)?.59％,蛋白活性調(diào)節(jié)(protein activityregulation)基因?yàn)?5.

4、43％,細(xì)胞結(jié)構(gòu)(cell structure)基因?yàn)?.12％,控制運(yùn)輸(transport)基因?yàn)?.55％,轉(zhuǎn)錄(transcription)基因?yàn)?.15％。
　　 在文庫(kù)中,核糖體蛋白的數(shù)量最多,為28個(gè),占全部EST序列的5.38％,有比較多的核糖體蛋白說(shuō)明在山葡萄果皮生命活動(dòng)過(guò)程中,蛋白質(zhì)合成活動(dòng)旺盛。文庫(kù)中與花色苷合成相關(guān)的基因包括查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)、類黃酮3’,5’羥化酶(

5、flavonoidflavonoid3’,5’-hydroxylase,F3’5’H)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GST)等,這些基因都與已知基因或者基因家族有高度相似性(Evalue<10-15,Identity>80％)。文庫(kù)中與香氣物質(zhì)形成相關(guān)的基因主要有脂肪氧化酶(Lipoxygenase)、苯丙氨酸解

6、氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase)、醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase)等8個(gè)酶基因,與成熟相關(guān)的基因有多聚半乳糖酶(Polygalacturonase)、成熟相關(guān)蛋白grip22(Ripening-related protein grip22)、果膠酶(Pectinesterase)、脂肪氧化酶(Lipoxygenase)。根據(jù)已有的文獻(xiàn)資料,從山葡萄成熟果皮的cDNA文庫(kù)中挑選了23個(gè)和