蘇云金芽胞桿菌芽胞和晶體形成相關功能基因研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)作為一類微生物農藥,因其殺蟲效果好、對人畜安全、不污染環(huán)境等優(yōu)點而得到廣泛應用,約占整個生物農藥市場的90％。與芽胞桿菌屬其它種相比,Bt的一個顯著特點就是在形成芽胞的同時能夠產生殺蟲晶體蛋白(ICPs)?？莶菅堪麠U菌作為模式菌株,有關芽胞形成的機制研究相對深入,而針對Bt殺蟲晶體的形成機制的研究還主要集中于殺蟲晶體蛋白基因的表達調控,關于晶體和芽胞形成相關基因關系

2、的報道還很少。因此,本研究通過對功能基因組學相關方法的運用。初步研究了蘇云金芽胞桿菌中分別位于染色體和質粒上的兩個基因,并對它們對芽胞和晶體形成的作用加以闡述,這將有助于闡明Bt芽胞、晶體形成機制,為改造更為安全、高效的工程菌株提供理論依據。
　　 本研究利用攜帶Mini-Tn10轉座子的pIC333溫敏載體,完成了B.thuringiensisHD73的轉座子突變體庫的構建,獲得了20,000株具有壯觀霉素抗性的突變體,并完成

3、了突變體庫的鑒定。經過篩選,獲得兩株不能產生芽胞和晶體的突變株。通過對突變株轉座子側翼序列的分析,確定了插入位點分別位于染色體上copG基因和質粒上尚無任何報道的一條基因(命名為11sc)內部,分別造成了9個堿基的重復,并研究了突變株產生芽胞、晶體的能力。因此,將突變株分別命名為HD73(copG)::Mini-Tn10和HD73(11sc)::Mini-Tn10。
　　 進一步構建了敲除copG部分和全部基因載體,分別命名為p

4、RN5101(copG△’)及pRN5101(copG△),將其分別導入HD73出發(fā)菌株,經高溫誘導突變,篩選獲得了缺失相應基因的突變株,分別命名為HD73(copG△)和HD73(copG△)。鏡檢結果顯示,雖然殺蟲蛋白的量較出發(fā)菌株少,但突變株依然有產生芽胞和晶體的能力。構建敲除11sc全部基因載體pRN5101(11sc△),經轉化、突變、篩選后獲得相應突變株HD73(11sc△),但仍未喪失產生芽胞、晶體的能力。