高效降解展青霉素海洋酵母的篩選、鑒定及降解特性研究.pdf

1、食品中展青霉素的污染非常普遍，嚴(yán)重危害人體健康。利用微生物降解展青霉素前景廣闊，本文篩選并鑒定出一株具有展青霉素高效降解特性的海洋酵母，對(duì)其生長(zhǎng)特性、展青霉素降解特性、安全性和降解機(jī)理進(jìn)行研究。
　　1.建立了培養(yǎng)液中展青霉素含量的檢測(cè)方法，并對(duì)驗(yàn)證了方法的有效性。樣品前處理采用乙酸乙酯萃取、碳酸鈉溶液凈化、無(wú)水硫酸鈉干燥，氮吹至干后，溶于乙酸溶液(pH4.0)中。展青霉素檢測(cè)采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器，ODS反相柱進(jìn)行分離，在

2、276nm下進(jìn)行檢測(cè)。該方法回收率為78.01-83.64％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.09-9.70％，檢測(cè)限和定量下限分別為0.08μg/mL和0.24μg/mL。方法穩(wěn)定性好，具有良好的精密度，前處理方法簡(jiǎn)單，試劑用量少，在短時(shí)間內(nèi)可處理大批量樣品，能夠滿足在實(shí)驗(yàn)室條件下展青霉素檢測(cè)快速、經(jīng)濟(jì)的要求。
　　2.篩選出一株能夠高效降解展青霉素的海洋酵母34號(hào)，該菌株對(duì)展青霉素降解率高，具有良好的毒素耐受性，與陸生酵母相比，在展青霉素降

3、解方面有很大優(yōu)勢(shì)。經(jīng)Biolog鑒定、26S分子鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，確定34號(hào)酵母為奧默柯達(dá)酵母，將其命名為Kodamare ohmeri HYJM34。
　　3.對(duì)K.ohmeri HYJM34生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)酵母生長(zhǎng)影響較大，最適培養(yǎng)溫度在25-28℃。在pH2-12之間酵母均可生長(zhǎng)，pH為6時(shí)生物量最大。接種量對(duì)酵母生長(zhǎng)影響不太明顯，酵母生物量隨著裝液量的增大而逐漸減小。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、部分因子實(shí)驗(yàn)、中心組合實(shí)

4、驗(yàn)及響應(yīng)面分析，得出K.ohmeriHYJM34的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖2％，蔗糖8.19％，酵母粉3％，MgSO40.25％，K2SO40.18％，培養(yǎng)24 h后酵母生物量可達(dá)到19.54±0.28 g/L。與YPD培養(yǎng)基相比，酵母生物量提高了174.1％，說(shuō)明該優(yōu)化培養(yǎng)基顯著提高了酵母的生物量。通過(guò)急性毒理實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，結(jié)果表明小鼠經(jīng)口毒性劑量大于15 g/kg·bw，該酵母為無(wú)毒級(jí)。
　　4.研究了K.ohm

5、eri HYJM34對(duì)展青霉素的降解特性。培養(yǎng)基中添加10μg/mL展青霉素時(shí)，酵母生長(zhǎng)受到抑制，生物量略有下降，但影響不大。展青霉素降解動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，K.ohmeri HYJM34在24 h內(nèi)對(duì)展青霉素的降解率接近100％，明顯強(qiáng)于目前報(bào)道的其它展青霉素降解菌。在溫度為35℃，pH為3-6，細(xì)胞濃度大于5×108個(gè)/mL時(shí)酵母降解展青霉素性能最佳;隨著毒素初始濃度的增大，酵母降解展青霉素的能力逐漸下降;金屬離子中Cu2+、Zn2+和

6、Fe3+明顯抑制酵母對(duì)展青霉素的降解，F(xiàn)e2+和Mg2+明顯促進(jìn)酵母降解展青霉素，其中Mg2+濃度為5mmol/L時(shí)，展青霉素降解率最高。
　　5.對(duì)K.ohmeri HYJM34降解展青霉素機(jī)理進(jìn)行初步研究。首先研究了酵母降低展青霉素的作用方式。酵母細(xì)胞滅活后，不能脫除展青霉素;對(duì)展青霉素處理的活性酵母細(xì)胞進(jìn)行破碎，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)均不含有展青霉素，說(shuō)明酵母對(duì)展青霉素的脫除是生物降解作用。對(duì)降解酶進(jìn)行定位分析，結(jié)果表明，K.o