類彈性蛋白修飾R型ω轉氨酶用于催化R苯乙胺.pdf

1、R型ω轉氨酶是指立體選擇性地催化R型胺發(fā)生轉氨反應且底物或產物沒有α-氨基酸或α-酮酸的一類酶，在輔酶5'-磷酸吡哆醛(PLP)的輔助下完成整個氨基互換催化過程。R型ω-轉氨酶在被用來拆分和合成手性胺上得到廣泛研究和應用。本課題從來源于Arthrobacter sp.KNK168中的R型ω-轉氨酶基因片段出發(fā)，構建多個載體，進行表達純化，探究了多酶體系在催化R-苯乙胺上的應用。
　　首先，本課題通過基因方法構建了R型ω-轉氨酶的p

2、ET28a-RTA表達載體，為了用更簡易更低成本的方法進行純化，本課題引入了類彈性蛋白純化標簽10倍體ELP，構建了表達載體pET28a-10ELP-RTA。對比酶活發(fā)現，單酶RTA酶活和10ELP-RTA的酶活非常接近，說明ELP并沒有影響RTA的酶活。從圓二色譜的結果也可以看到兩種蛋白的二級結構相似。
　　隨后，為了在丙酮酸不足的條件下使反應平衡向正向移動，利用DAAO催化副產物D-Ala反應生成丙酮酸，從而實現丙酮酸循環(huán)，本

3、課題在反應體系中引入了DAAO構建雙酶反應體系。從轉化率結果來看:RTA單酶轉化率較低，而雙酶體系13h的轉化率高達99.6％。通過激光共聚焦顯微鏡表征R-苯乙胺呈現微米級的液滴，ELP-RTA也發(fā)生微米級大小的自聚，但當R-苯乙胺和ELP-RTA，ELP-DAAO組成的雙酶體系混合時就形成了類似網狀的形態(tài)，結合轉化率結果，雙酶的網狀形態(tài)有利于反應達到雙酶引發(fā)的緊密而連續(xù)催化效果。單一的酶系統，在反應介質中，ELP-RTA自組裝形成微米

4、大小的酶集群，底物R-苯乙胺也形成了微米大小的液滴。酶集群和底物液滴的親密接觸提供了高底物濃度的微環(huán)境來接近酶，促進底物分子的擴散到活性位點。對于雙酶系統，ELP-RTA和ELP融合DAAO組裝形成雙酶復合物，形成集群的幅度比單一酶大得多，大大地提高了轉化率。
　　最后，利用DAAO催化D-Ala的反應產生丙酮酸和H2O2，而CAT可以又將H2O2分解成H2O和O2，應用構建的內含肽介導的RTA-DAAO和CAT-DAAO雙酶剪接