谷胱甘肽親和層析介質制備及其對蛋白的純化.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉移酶融合表達系統(tǒng)是通過大腸桿菌進行蛋白表達、純化和檢測的重要系統(tǒng)。此系統(tǒng)表達的蛋白一般在N末端融合上可溶性谷胱甘肽-S-轉移酶作為標簽。由于谷胱甘肽-S-轉移酶與谷胱甘肽能夠特異性的結合，因此可以通過谷胱甘肽親和層析介質對谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白進行分離、富集和純化。以瓊脂糖凝膠4 FF為基質，1，4-丁二醇二縮水甘油醚為活化劑，通過活化、偶聯(lián)谷胱甘肽(GSH)，優(yōu)化活化及偶聯(lián)條件，得到GSH親和層析介質。實驗結果表

2、明:活化及偶聯(lián)的優(yōu)化條件為10mL基質加入0.42g NaOH，15mL DMSO，15mL BDGE，反應溫度為40℃，反應時間為6h。在此條件下，環(huán)氧基修飾密度可達60-65μmol/mL;當偶聯(lián)溶液pH6.5時，所制備的自制介質載量可達14.19±0.98mg/mL。以此介質對谷胱甘肽-S-轉移酶及融合蛋白進行純化，結果表明該介質純化效果較好、穩(wěn)定性較搞，可重復使用。
　　丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogena

3、se，EC l.4.1.1)是一種以煙酰胺腺嘌呤(NAD+)為輔酶的氨基酸脫氫酶，可逆催化丙氨酸的氧化脫氨反應生成丙酮酸，氨以及NADH。晶體結構解析酶蛋白空間結構為深入闡述酶的催化機理提供更為有利的條件。本文以巨大芽孢桿菌WSH-002菌株（Bacillus.Megaterium WSH-002，GenBank No.345442329）基因組為模版，將目的基因克隆到表達載體，得到重組質粒pET-28a-Ald、pGEX-6P-1/A

4、ld，并分別轉入到BL21(DE3)，IPTG低溫誘導后均為大量可溶性表達。菌體上清液分別經(jīng)商業(yè)鎳柱、自制GSH層析柱和尺寸排除色譜純化后均獲得高純度的Aid WSH-002蛋白。對高純度蛋白采用晶體生長試劑盒篩選初步結晶條件并優(yōu)化。蛋白濃度為12mg/mL，結晶溶液為0.03 M檸檬酸pH7.5，16％(w/v) PEG3350時，晶體衍射率為2.22(A)屬于三方晶系;蛋白濃度15mg/mL，結晶溶液為0.1 M HEPES pH8