卡介菌多糖核酸脂質體的制備及其免疫增強作用與安全性研究.pdf

1、卡介菌多糖核酸(Bacillus Calmette Guerin polysaccharide nucleic acid，BCG-PSN)是一種新型免疫調節(jié)劑，具有以下幾方面作用:提高T淋巴細胞免疫功能;激活T淋巴細胞促進白細胞介素等分泌從而產(chǎn)生多種免疫調節(jié)的淋巴因子;增強巨噬細胞功能，提高機體殺傷細菌、病毒能力;提高溶菌酶活力。經(jīng)臨床試驗證實，BCG-PSN目前已成為防治哮喘、慢性支氣管炎、風濕性關節(jié)炎、神經(jīng)性皮炎等較為理想的藥物。為

2、進一步提高BCG-PSN的療效并減少其不良反應，在本試驗中采用獨特的低溫細菌細胞破壁、熱酚法提取法分離和提純BCG-PSN，并設計了適合本藥物的的薄膜蒸發(fā)法制備BCG-PSN脂質體。同時為了提高穩(wěn)定性，制備了BCG-PSN凍干脂質體。在此基礎上，對BCG-PSN免疫增強作用及其安全性進行評價，為BCG-PSN在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應用提供試驗和理論依據(jù)。
　　1.BCG-PSN制備條件的優(yōu)化及其質量控制為了優(yōu)化BCG-PSN制備工藝，試

3、驗采用超聲破碎BCG-PSN的細胞壁，利用熱酚法除去菌體蛋白，以多糖核酸的含量為考察指標，選取苯酚濃度、熱酚次數(shù)以及乙醇用量三個因素，每個因素三個水平，通過正交試驗L9(33)確定BCG-PSN的最佳提取工藝條件。結果表明:對BCG-PSN提取量影響因素的大小依次是熱酚次數(shù)、苯酚濃度、乙醇用量，并且90％苯酚、熱酚處理次數(shù)為4次、濃縮液∶乙醇為1∶5時，所獲得的BCG-PSN含量最大(96.488％)，而且對上述最佳工藝進行了重復性驗證

4、，證實其具有良好的重現(xiàn)性。
　　2.BCG-PSN脂質體的制備根據(jù)水溶解性藥物的特點，本論文選用經(jīng)典的薄膜蒸發(fā)法制備BCG-PSN脂質體（下圖是磷脂雙分子層示意圖，其中BCG-PSN所在位置在雙分子層最中間部分），并采用星點設計-歸一化法優(yōu)化普通BCG-PSN脂質體(FBL)的處方。并在單因素考察的基礎上，確定三個自變量為BCG-PSN/卵磷脂(％，w/w)、膽固醇/卵磷脂(％，w/w)以及BCG-PSN加入量(mg);因變量為包

5、封率(％)、收率(％)、粒徑與5000nm的差以及徑距。結果表明，以優(yōu)化處方制備樣品，各指標實測值與預測值偏差較小。
　　3.BCG-PSN凍干脂質體的制備及其穩(wěn)定性本論文通過正交試驗得到最佳處方，確定BCG-PSN凍干脂質體(PBL)的最佳參數(shù)。在此基礎上，對修飾前后BCG-PSN脂質體的性質及其在光照、分散介質、模擬生物環(huán)境中以及長期放置穩(wěn)定性進行了研究，并同時以BCG-PSN注射液為對照。結果顯示BCG-PSN凍干脂質體體外

6、穩(wěn)定性較普通BCG-PSN脂質體更強。
　　4.BCG-PSN與IBD疫苗聯(lián)合應用對雞的免疫增強作用0.6 mg·kg-1，0.3mg·kg-1，0.15 mg·kg-1，0.075 mg·kg-1和0.0375 mg·kg-1的BCG-PSN與IBD疫苗聯(lián)合應用于人工感染IBD的受試雛雞，通過測定免疫器官指數(shù)、IBD抗體滴度、外周血T淋巴細胞亞群、巨噬細胞吞噬活性、血清IFN-γ及IL-2濃度等免疫學指標，研究BCG-PSN和I

7、BD疫苗的免疫協(xié)同作用效果。結果表明，與單用IBD疫苗比較，極高劑量(0.6 mg·kg-1) BCG-PSN能夠極顯著地升高脾臟和胸腺系數(shù)，中（0.15 mg·kg-1）、低（0.075 mg·kg-1）劑量BCG-PSN能極顯著延緩法式囊退化;中劑量（0.15 mg·kg-1）的BCG-PSN能夠明顯誘導IBD抗體的產(chǎn)生和提高CD4+/CD8+T淋巴細胞比值，維持CD4+和CD8+T淋巴細胞的平衡;BCG-PSN顯著升高雞血清IFN

8、-γ和IL-2含量，而且作用持續(xù)時間相對較長，尤其對IL-2的持續(xù)誘導效果更為明顯。因此，與IBD疫苗聯(lián)合應用，BCG-PSN能夠劑量相關性的促進雞機體產(chǎn)生相應抗體，同時增強機體體液免疫和細胞免疫作用;BCG-PSN對非特異性免疫沒有明顯影響。
　　5.BCG-PSN安全性以藥物最大溶解度為最高劑量，劑間比1∶0.83，小鼠腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，測定其急性毒性;小鼠腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，連續(xù)給藥14d，觀察

9、其亞慢性毒性;小鼠腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，以小鼠骨髓微核和精子畸形為指標，評價其其致突變作用。結果表明，腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，最高劑量2000 mg·kg-1·bw-1，連續(xù)觀察14d，小鼠僅出現(xiàn)輕微的中毒癥狀，未出現(xiàn)死亡，故小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大給藥量為2000 mg·kg-1·bw-1;與正常對照組比較，亞慢性毒性試驗小鼠在整個試驗周期內反應靈敏、活動正常且未出現(xiàn)死亡;BCG-PSN高、中劑量組小鼠進

10、食量在前期顯著降低，高劑量組小鼠體重在試驗前期顯著下降;高劑量組脾臟指數(shù)顯著升高，高、中劑量組白細胞總數(shù)、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積和平均紅細胞容積顯著降低，尿素氮顯著升高，高劑量組白蛋白顯著降低。其他各項指標及病理組織學檢查結果與正常對照組沒有顯著性差異。小鼠致畸初步試驗結果表明，BCG-PSN對骨髓微核和精子畸形試驗結果均為陰性。實驗結論，小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大給藥量為2000 mg·kg-1·bw-1，長期大劑量應