用分子印跡技術(shù)分離純化菇類抗氧化成分以及該成分在氧化應(yīng)激中的保護機制.pdf

1、天然抗氧化成分因具有高效低毒和多重抗氧化活性而備受研究者的關(guān)注。菇類作為一種重要的天然資源是抗氧化活性成分的主要來源之一。
　　本研究利用分子印跡技術(shù)，以天然抗氧化活性成分為模板分子，采用本體聚合法合成分子印跡聚合物，從致孔劑、功能單體以及交聯(lián)劑等方面對分子印跡聚合物的制備過程進行優(yōu)化，并將制備的分子印跡聚合物作為固相萃取的吸附材料，從菇類提取物中分離富集天然抗氧化成分。分子印跡聚合物的制備和應(yīng)用主要從以下三方面進行:
　　

2、(1)以咖啡酸苯乙酯為模板分子，4-乙烯吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑合成分子印跡聚合物。實驗考察了分子印跡聚合物對模板分子咖啡酸苯乙酯和結(jié)構(gòu)類似物咖啡酸的選擇性，并通過吸附動力學和吸附等溫線對聚合物進行表征。將咖啡酸苯乙酯分子印跡聚合物作為固相萃取的吸附材料，從25種菇類中分離富集咖啡酸苯乙酯和咖啡酸。實驗結(jié)果表明，從7種菇類中檢測到咖啡酸的存在，含量在0.004-0.340μg g

3、-1（dw）之間，其中裂褶菌、巴氏蘑菇、杏鮑菇、黃傘以及鮑魚菇為首次報道分離到咖啡酸。此外，與商品化C18柱相對比，分子印跡柱對目標物表現(xiàn)出較好的親和性和選擇性。
　　(2)以沒食子酸為模板分子，4-乙烯吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑合成分子印跡聚合物。本實驗比較了模板分子沒食子酸和4種結(jié)構(gòu)類似物（焦性沒食子酸、間苯二酚、原兒茶酸以及3，5-二羥基甲苯）在分子印跡柱上的吸附能力，

4、并對聚合物的吸附性能進行表征。沒食子酸分子印跡聚合物對于模板分子沒食子酸表現(xiàn)出選擇性高、傳質(zhì)速度快等特點。25 mg L-1的沒食子酸在50 mg分子印跡物中靜態(tài)吸附120 min后，基本達到平衡。將沒食子酸分子印跡柱應(yīng)用于25種菇類粗提物的分離純化，并從9種菇類中檢測到?jīng)]食子酸，含量在0.044-0.528μg g-1（dw）之間，其中從鹿茸菌中分離得到了沒食子酸的結(jié)構(gòu)類似物原兒茶酸。本實驗對沒食子酸分子印跡柱與商品化C18柱對菇類粗

5、提物的分離效果進行了比較，結(jié)果表明，分子印跡柱能夠特異性的富集沒食子酸，而C18柱對菇類粗提物的吸附能力較差。
　　(3)以硬毛素為模板分子、丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯作為功能單體和交聯(lián)劑、四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑制備得到的分子印跡聚合物對模板分子硬毛素表現(xiàn)出較強的選擇性，對硬毛素的吸附能力明顯強于結(jié)構(gòu)類似物hispolon和inotilone。同樣，通過吸附動力學模型和吸附等溫模型對分子印跡聚合物的吸附性能進行了

6、評價。以此分子印跡物作為固相萃取吸附填料對8種菇類提取物進行分離富集，從3種菇類中檢測到硬毛素，其中桑黃中硬毛素的含量最高，為8.44μg g-1（dw）。與商品化C18柱相比，以分子印跡聚合物作為吸附材料的固相萃取柱對目標物表現(xiàn)出特異的吸附能力，從而起到富集目標物、純化樣品的目的。
　　為了進一步評價所合成的分子印跡聚合物對目標活性成分的分離富集能力，本研究檢測了菇類粗提物在經(jīng)過分子印跡柱萃取后，樣品的抑制紅細胞溶血活性、抑制脂

7、質(zhì)過氧活性以及超氧陰離子清除活性的變化情況，從抗氧化活性的角度考察分子印跡柱的分離富集效果。實驗結(jié)果表明，大多數(shù)含有目標活性成分的菇類粗提物在經(jīng)過分子印跡柱萃取分離后，其抗氧化活性有所提高，說明菇類粗提物中的雜質(zhì)成分被去除的同時活性成分得到富集。
　　氧化應(yīng)激引起的細胞氧化損傷而造成的細胞凋亡在疾病的發(fā)生和發(fā)展中所起到的作用越來越受到研究人員的關(guān)注。因此，對活性氧造成機體氧化損傷的機制以及抗氧化活性成分作用途徑的研究尤為重要。本研

8、究利用H2O2誘導小鼠脾細胞氧化損傷構(gòu)建細胞氧化應(yīng)激模型，以從美味牛肝菌、鹿茸菌和桑黃中分離得到的活性成分Be、Rf和Pi作為實驗對象，評價天然抗氧化成分對氧化損傷細胞的保護作用。H2O2的暴露會導致小鼠脾細胞存活率的下降，并且與H2O2呈現(xiàn)劑量和時間依賴性關(guān)系。通過流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠明顯提高細胞內(nèi)活性氧水平。Be、Rf和Pi能夠顯著抑制H2O2誘導的小鼠脾細胞氧化損傷，使細胞存活率從63.7％提高到73.7-77.7％，

9、并且與活性成分的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，同時三種活性成分的預保護可以抑制H2O2誘導的胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。為了進一步研究活性成分的作用途徑，本研究從線粒體依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑和死亡受體介導的信號轉(zhuǎn)導途徑為切入點，探討天然活性成分發(fā)揮其抗氧化活性的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導小鼠脾細胞氧化損傷主要是通過線粒體依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)的，并未激活死亡受體介導的凋亡通路中的Fas/FasL途徑。天然活性成分對H2O2誘導小鼠脾細胞氧化損傷的保護

10、作用與其對細胞線粒體的保護作用密切相關(guān)。Be、Rf和Pi都能不同程度的提高因H2O2造成的細胞線粒體膜電位降低，恢復線粒體正常生理功能。同時，也抑制了線粒體內(nèi)促凋亡因子細胞色素C的釋放。活性成分還能通過提高抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達量，抑制Caspase-3、Caspase-9激活的方式阻斷活性氧介導的細胞氧化損傷。抑制細胞凋亡，從而起到抗氧化作用。
　　本研究將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于菇類中天然抗氧化成分的分離純化，并對