能源微藻篩選及其基因工程基礎(chǔ)研究.pdf

1、隨著日益增長的能源需求,許多國家都已開展了各種可再生能源的開發(fā)。比較傳統(tǒng)的化石燃料,生物燃料更為環(huán)保,且可再生,能完全取代傳統(tǒng)的燃料。然而生物燃料的生產(chǎn)原料成本過高限制了當(dāng)前生物燃料的普及。尋求更為廉價的生物燃料的原料是目前生物燃料研究領(lǐng)域的主要方向。微藻為光合自養(yǎng)微生物,比較于其他油料作物,其具有生長速度快,脂質(zhì)含量高,且無需耕地不與糧食作物爭地等諸多優(yōu)點,是目前最有優(yōu)勢的生物能源原料。進(jìn)一步提高微藻的生物量和脂質(zhì)含量,提高其生物能源

2、產(chǎn)量,將使其在生物能源生產(chǎn)中更具優(yōu)勢,這是微藻生物能源領(lǐng)域的努力方向和研究熱點。
　　本論文針對生物能源微藻的基因工程進(jìn)行了基礎(chǔ)研究,主要開展了微藻選取、培養(yǎng)優(yōu)化以及以進(jìn)一步基因改造為目的的基礎(chǔ)研究,包括,脂質(zhì)代謝途徑研究和基因工程改造微藻的后續(xù)研究基因篩選。同時在構(gòu)建載體進(jìn)行工程微藻改造過程中,針對實驗需要,開發(fā)了微藻colony PCR技術(shù)。
　　(1)高生物量高脂質(zhì)微藻的篩選
　　從各地水樣中篩選的多株微藻中選取

3、了一株新的微藻藻株,經(jīng)鑒定為Chlorella sorokiniana,命名為CS-01。該藻株生長速度較快,pH適應(yīng)范圍廣,7～10之間均能很好地生長,在pH9時生長最佳;最適培養(yǎng)溫度為30℃,20℃～35℃均能較好生長。最適氮源為硝酸鈉,也能很好的利用尿素作為氮源,不能較好利用硫酸銨作為氮源生長。也能利用多種碳源生長,其中以葡萄糖生長時,生長和脂質(zhì)含量最佳。鑒于該藻在生物燃料的應(yīng)用潛力,選為本研究的目的微藻。
　　(2)目的微

4、藻針對生物燃料生產(chǎn)的培養(yǎng)優(yōu)化
　　與其他限制培養(yǎng)基中的氮源來提高脂質(zhì)含量的方法不同,經(jīng)由兼養(yǎng)、異養(yǎng)和足量鐵培養(yǎng),淡水微藻C. Sorokiniana CS-01生物產(chǎn)量和脂質(zhì)含量都有大幅提升,其中,兼養(yǎng)時,細(xì)胞量是光合自養(yǎng)的4.2倍,脂質(zhì)含量從光合自養(yǎng)的22％左右提高到50％。異養(yǎng)時,細(xì)胞量是光合自養(yǎng)的9.2倍,脂質(zhì)含量超過50％。鐵培養(yǎng)時,脂質(zhì)濃度達(dá)到最大為36％,是完全不加鐵培養(yǎng)(12％)的3倍,最高細(xì)胞濃度為無鐵培養(yǎng)物的1.

5、7倍。且該藻株也展現(xiàn)了相對其他小球藻更強的葡萄糖耐受能力,比海洋微藻C.vulgaris更強的鐵耐受能力。經(jīng)兼養(yǎng)和異養(yǎng)的小球藻CS-01的脂質(zhì)主要為中性脂且飽和度高,能夠用于生產(chǎn)高質(zhì)量的生物燃料。且該藻株展現(xiàn)了相對其他小球藻更強的葡萄糖耐受能力,比海洋微藻C.vulgaris更強的鐵耐受能力。
　　(3)在脂質(zhì)高積累和低積累時脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)差異分析
　　通過不同培養(yǎng)條件下,基因表達(dá)變化與細(xì)胞生長和脂質(zhì)含量對應(yīng)關(guān)系,本研

6、究發(fā)現(xiàn)rbcL基因的表達(dá)可以用來反映光合作用的速率;兼養(yǎng)條件下,C.Sorokiniana CS-01優(yōu)先進(jìn)行異養(yǎng)。在完全異養(yǎng)初期,參與光合作用的rbcL基因仍保留少量表達(dá),但進(jìn)入穩(wěn)定期表達(dá)量則急劇降低。AccD基因的表達(dá)水平除在異養(yǎng)時與殘余葡萄糖濃度相關(guān)外,在其他培養(yǎng)方式下則與脂質(zhì)含量相關(guān),因此,可作為在非異養(yǎng)條件下評估脂質(zhì)含量的分子檢驗手段之一。C.sorokiniana CS-01同質(zhì)ACCase和異質(zhì)ACCase保留著不同分工,

7、但同質(zhì)ACCase對總的脂質(zhì)積累貢獻(xiàn)較少。鐵濃度增高能同時提高rbcL,accD和acc1基因的表達(dá)量,可能是高濃度的鐵造成細(xì)胞脂質(zhì)含量提高的原因之一。
　　(4)在脂質(zhì)高積累和低積累時Genefishing分析
　　Genefishing方法是研究基因組整體表達(dá)差異的簡單快捷的方法,并能用來快速尋找那些表達(dá)量受特定條件影響顯著的基因。經(jīng)由Genefishing分析了不同濃度鐵培養(yǎng)時基因的表達(dá)圖譜,證實了鐵能促進(jìn)許多基因的表

8、達(dá),同時在Genefishing發(fā)現(xiàn)的序列中,經(jīng)由生物信息學(xué)方法,發(fā)現(xiàn)了兩個可能與脂質(zhì)合成代謝相關(guān)的基因,它們也隨鐵的濃度的增加而表達(dá)量提高。
　　(5)目的微藻的轉(zhuǎn)錄組測序及其脂質(zhì)合成代謝途徑分析
　　經(jīng)由改進(jìn)的cDNA文庫制備方法,本研究首次對淡水微藻C.sorokiniana進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測序,并進(jìn)行了序列片段的拼接,對拼接序列進(jìn)行基因本體分析和進(jìn)一步的序列功能注釋,獲得了該藻大量基因的信息,進(jìn)一步充實了微藻基因庫信息

9、。經(jīng)由轉(zhuǎn)錄文庫中出現(xiàn)的基因所編碼的酶,預(yù)測了從CO2到細(xì)胞主要中性脂Triacylglycerols(TAG)合成的完整路徑,以及脂肪酸的合成、延長、代謝途徑。標(biāo)記了TAG合成途徑上的分支點,進(jìn)而展現(xiàn)碳流向可能具有的分支,為脂質(zhì)提高的基因工程指明了方向。本研究也識別了大量與生長和死亡相關(guān)的基因。在本研究中獲得的大量基因和代謝途徑信息,為基因?qū)用娓脑煳⒃逄峁┝擞辛Φ睦碚撝С帧?br>　　(6)脂質(zhì)高積累和低積累時全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異
　

10、　對微藻在不同脂質(zhì)高積累和低積累時的全轉(zhuǎn)錄庫進(jìn)行了測序,比較了不同培養(yǎng)條件下全基因組的表達(dá)差異變化。發(fā)現(xiàn)了大量隨脂質(zhì)變化基因,且即使在不同個樣品這些基因的表達(dá)仍展現(xiàn)了與脂質(zhì)變化完全相同的關(guān)聯(lián),其中許多基因目前功能尚未確定,但根據(jù)其表達(dá)變化,很可能與脂質(zhì)合成相關(guān),這些基因的進(jìn)一步解析和驗證,將有助于深入了解微藻的脂質(zhì)合成代謝,以及發(fā)現(xiàn)更多新的脂質(zhì)合成相關(guān)基因。此外,也發(fā)現(xiàn)了一些功能未知,但在多個樣品間都具有超高表達(dá)量的基因,其表達(dá)操作元件

11、能夠為構(gòu)建高表達(dá)載體提供參考。
　　(7)微藻colony PCR技術(shù)
　　構(gòu)建工程微藻的轉(zhuǎn)化過程中需要驗證大量的微藻轉(zhuǎn)化體,但是獲得PCR驗證所需DNA模板卻非常費時費力。因此,開發(fā)微藻的colony-PCR技術(shù),可以不對微藻進(jìn)行單獨培養(yǎng)和DNA提取,能快捷識別轉(zhuǎn)化子,這能大幅提高基因工程改造微藻的效率。本研究比較了5種colony PCR DNA析出液用于微藻colony-PCR的效果。結(jié)果顯示Chelex-100效果最