無(wú)乳鏈球菌表面蛋白重組制備及檢測(cè)方法初步建立.pdf

1、奶牛乳腺炎是世界奶牛業(yè)的主要危害因素之一，它不僅影響產(chǎn)奶量，造成經(jīng)濟(jì)損失，而且影響牛奶的品質(zhì)，危害人類的健康。而無(wú)乳鏈球菌是引起奶牛乳腺炎的常見(jiàn)病原微生物之一，因而是乳業(yè)關(guān)心的主要問(wèn)題。建立無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，對(duì)于提高奶制品質(zhì)量與安全，推進(jìn)奶牛業(yè)發(fā)展，促進(jìn)人類健康意義重大。本研究克隆表達(dá)了三種無(wú)乳鏈球菌表面蛋白(Rib，Sip，Alpha)，并分別進(jìn)行了抗體制備，為無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)試紙條和多價(jià)疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ)。
　

2、　本實(shí)驗(yàn)首先將6種血清型的ATCC無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行了活化，并分別提取了基因組DNA。根據(jù)Rib，Sip，Alpha三種表面蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以不同標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為453bp、1302bp和699bp的片段，將片段克隆連接至pMD18-T載體進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明獲得的片段為正確的目的基因。將rib和sip基因片段亞克隆至重組表達(dá)載體pET26b、alpha基因片段亞克隆至重組表達(dá)載體pGEX-

3、4T-1，并利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示3種基因均能夠重組表達(dá)，外源蛋白的分子量分別為18kDa、61kDa和52kDa，與預(yù)期大小相符，但是其中Rib和Alpha形成包涵體。將3種基因進(jìn)行大規(guī)模重組表達(dá)并對(duì)形成的包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性后，利用親和純化獲得了純度較高的目的蛋白。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定，3種外源蛋白與與無(wú)乳鏈球菌Rib，Sip以及Alpha的相似度分別達(dá)到99.99％，100％以及100％。將三種蛋白分別免疫新西