新型功能化DNA探針用于轉錄因子的熒光生物傳感研究.pdf

1、轉錄因子(Transcription factors，TFs)是一類序列特異性DNA結合蛋白(DNA-binding proteins)，通過結合基因調控區(qū)域中特定的雙鏈DNA序列(dsDNA)調控目標基因的轉錄。人類細胞中存在大約1400種轉錄因子。轉錄因子表達水平的正常變化對于細胞發(fā)育，分化和增長等細胞過程是必不可少的。但轉錄因子表達水平的異常變化將會導致發(fā)育障礙，異常激素反應，炎癥和癌癥等一系列疾病。它們的表達水平靈敏地反映細胞發(fā)

2、展和疾病狀態(tài)。因此，轉錄因子已被做為臨床診斷和藥物開發(fā)的潛在目標物。靈敏檢測轉錄因子表達水平對于闡明基因調控機制，臨床診斷和藥物開發(fā)具有重要意義。
　　轉錄因子的檢測方法中，熒光檢測方法具有操作簡單、安全和靈敏度高的優(yōu)勢，獲得廣泛應用。其中，識別探針構象轉變法是最常用的一種轉錄因子的熒光檢測方法。此法是利用轉錄因子與識別探針發(fā)生特異性結合后，導致識別探針的構象發(fā)生改變，進而引起熒光信號的變化，實現(xiàn)對轉錄因子的檢測，此法檢測步驟簡便

3、、快速，但識別探針的設計較為復雜，應用范圍受到限制。
　　本論文以上述科學問題為研究目標，構建了2種多功能DNA探針，建立了2種解決方案。主要內容歸納如下:
　　1.中性pH環(huán)境中Ag+隱定的自組裝triplex DNA分子開關(Ag+-stabilizedself-assembly triplex DNA molecular switch，Ag+-STDMS)用于轉錄因子的靈敏檢測
　　近年來，三螺旋DNA(trip

4、lex DNA)已被廣泛應用于序列特異性標記，調控基因表達以及構建基于DNA的納米結構領域。其中，包含C+·G。C和T·A。T（·代表Hoogsteen氫鍵，代表Watson-Crick氫鍵）的triplex DNA最為常用。在triplex DNA的形成過程中，含有同型嘧啶鏈（胞嘧啶C和胸腺嘧啶T）的寡核苷酸（稱之為triplex-forming oligonucleotides，TFO）需要質子化后才能結合雙鏈DNA的嘌呤鏈（含有腺

5、嘌呤A和鳥嘌呤G），進而形成triplex DNA。因此，這種triplex DNA只能在弱酸性環(huán)境中形成及存在，極大地限制了它的應用范圍。Ag+能夠特異性地結合triplex DNA中的C+·G。C，并將C+·G。C中的H+置換形成Ag+C·G。C，使triplex DNA能夠在中性及弱堿性環(huán)境中穩(wěn)定存在，這極大拓寬了triplex DNA的應用領域?？紤]到細胞中存在的許多轉錄因子的識別雙鏈均富含G-C堿基對（例如，核轉錄因子NF-κ

6、B p50），因此，我們構建了一種中性pH環(huán)境中Ag+穩(wěn)定的自組裝triplex DNA分子開關（Ag+-STDMS），成功應用于NF-κB p50及實際生物樣品的靈敏檢測，檢測限(LOD)分別為25pM和0.8ng/μL，優(yōu)于現(xiàn)有的一些檢測方法。此外，本文提出的檢測方法檢測步驟簡便、快速。Ag+-STDMS易于設計，只要簡單地改變相應的組成序列即可用于其它轉錄因子的靈敏檢測，具有通用性。
　　2.GO熒光開關輔助的多功能發(fā)夾探針

7、(muitifunctional G-quadruplex-hairpinprobe，MGHP)用于轉錄因子的免標記、靈敏檢測
　　氧化石墨烯(GO)作為一種水溶性單原子厚度二維納米材料，由于其獨特的電子、機械和熱力學性質，已經引起廣泛關注。它能夠通過非共價π-π堆疊相互作用吸附單鏈DNA，并能猝滅標記在單鏈DNA上的熒光團的熒光。與有機猝滅劑或其它納米材料相比，GO具有優(yōu)越的淬火效率，已被用于開發(fā)多種生物傳感器。本文中我們利用G

8、O的高效吸附作用和熒光猝滅屬性，設計了一種具有三重功能（環(huán)部單鏈吸附于GO表面，莖部雙鏈結合目標物轉錄因子，末端G四倍體作為信號載體）的發(fā)夾探針（MGHP），構建了一種簡單、免標記的熒光檢測方法，實現(xiàn)了對NF-κBp50及實際樣品的的靈敏檢測，LOD分別為0.2nM和7.8ng/μL。
　　在疾病的早期階段，轉錄因子顯示相對較低的表達水平，因此，通過適當?shù)男盘柗糯蠹夹g對轉錄因子進行高靈敏檢測對于疾病的早期診斷具有重要的現(xiàn)實意義。外

9、切酶切割輔助擴增法是一種常用的轉錄因子的熒光放大檢測方法。此法是利用外切酶(ExoⅠ、ExoⅢ)能夠切割單鏈DNA、雙鏈DNA的特性，當轉錄因子與識別探針結合形成復合物后，切割去除過量的識別探針。形成的復合物進入后續(xù)信號放大過程，實現(xiàn)轉錄因子的高靈敏檢測。此法靈敏度高，但需要借助一種或兩種外切酶切割去除過量的識別探針，切割不完全易引起假陽性信號。
　　本論文以上述科學問題為研究目標進一步構建了2種多功能DNA探針，建立了2種解決方

10、案。主要內容歸納如下:
　　3.共區(qū)域化識別激活的級聯(lián)鏈置換擴增用于轉錄因子的高靈敏檢測
　　結合誘導DNA鏈的共區(qū)域化，進而觸發(fā)DNA組裝已經引起廣泛關注。其中，目標物結合觸發(fā)的鏈置換是最常見的一種組裝途徑。在本文中，將目標物轉錄因子的識別序列分裂為三個小片段DNA，稱之為分裂識別組件，構建一種轉錄因子的新型識別方式-共區(qū)域化識別。目標物識別三個分裂識別組件，使其發(fā)生共區(qū)域化，進而激活后續(xù)級聯(lián)的鏈置換擴增和指數(shù)滾環(huán)擴增，實

11、現(xiàn)了對NF-κBp50及實際樣品的的高靈敏檢測，LOD分別為0.25pM和0.04ng/μL，優(yōu)于現(xiàn)有的大多數(shù)檢測方法。更重要的是，反應中過量的分裂識別組分在試驗溫度(37℃)無法自行雜交成穩(wěn)定雙鏈結構進而引發(fā)后續(xù)的信號放大過程，因此，不需要任何外切酶的參與去切割過量的分裂識別組件，消除了過量識別探針去除不完全引起的假陽性信號。
　　4.協(xié)同的掩蔽效應和結合保護效應介導的級聯(lián)鏈置換擴增用于轉錄因子的高靈敏檢測
　　堿基互補配

12、對雜交是DNA的基本性質，具有互補堿基的單鏈DNA能夠快速而徹底地配對雜交成為穩(wěn)定的雙鏈結構。無機化學中的掩蔽反應是最常用的去除雜質的手段。在本章中，將掩蔽效應應用于生物傳感領域，設計了與識別探針互補的DNA掩蔽鏈，去除過量發(fā)夾識別探針，獲得了較好的掩蔽效果，反應不需要任何外切酶的參與去切割過量的識別探針，消除了過量識別探針去除不完全引起的假陽性信號。同時利用目標物的結合保護效應，觸發(fā)級聯(lián)擴增，對NF-κBp50及實際樣品進行高靈敏檢測