不同種屬乙酰羥基酸合成酶亞基間相互作用的研究.pdf

1、乙酰羥基酸合成酶(Acetohydroxyacid synthase[AHAS]，EC2.2.1.6)是細(xì)菌、真菌和植物內(nèi)支鏈氨基酸生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵性的酶。研究表明AHAS具有重要的農(nóng)學(xué)意義，它是目前多種商品化除草劑的作用靶標(biāo)。但除草劑過(guò)度、單一和長(zhǎng)期大面積的使用也引發(fā)了雜草抗性問(wèn)題。因此充分利用已經(jīng)被實(shí)踐證明了的超高效除草劑靶酶AHAS，發(fā)展新型綠色農(nóng)藥，是一個(gè)很值得關(guān)注的課題。
　　 研究表明，不同來(lái)源的AHAS全酶

2、由催化亞基和調(diào)控亞基組成。其中催化亞基含有酶催化中心，AHAS的活性位點(diǎn)位于催化亞基二聚體界面上；調(diào)控亞基則調(diào)控酶活性及穩(wěn)定性，并授予酶對(duì)支鏈氨基酸反饋調(diào)控的敏感性。因此，AHAS催化亞基和調(diào)控亞基間的相互作用以及催化亞基之間的聚合作用對(duì)酶行使全部機(jī)制極為重要。我們大膽設(shè)想AHAS催化亞基與調(diào)控亞基之間以及催化亞基之間的作用界面很有可能成為潛在的除草劑靶標(biāo)，靶向這些亞基間作用界面可以開發(fā)新型的綠色農(nóng)藥。
　　 本論文中我們采用化

3、學(xué)生物學(xué)手段來(lái)研究這兩種重要的亞基相互作用，主要包括以下三方面的工作：
　　 一、構(gòu)建了煙草AHAS及酵母AHAS催化亞基和調(diào)控亞基基因表達(dá)體系，摸索并建立了擬南芥、煙草和酵母AHAS蛋白的表達(dá)純化體系。
　　 二、通過(guò)酶活性和酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)測(cè)定來(lái)研究不同種屬(大腸桿菌、擬南芥、煙草和酵母)AHAS催化亞基和調(diào)控亞基間同源或異源的重組作用。結(jié)果表明基因表達(dá)體系和蛋白表達(dá)純化體系構(gòu)建成功，調(diào)控亞基可以成功激活同源催化亞基；另

4、外，大腸桿菌ALIAS同功酶Ⅰ、Ⅲ之間，大腸桿菌AHASⅢ調(diào)控亞基和擬南芥AHAS催化亞基之間可以實(shí)現(xiàn)異源激活，說(shuō)明了AHAS催化亞基與調(diào)控亞基的作用界面具有一定的保守性，為我們研究該界面提供了重要信息。
　　 三、本文基于已報(bào)道的擬南芥AHAS催化亞基晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了破壞擬南芥AHAS催化亞基聚合界面氫鍵作用的突變體。通過(guò)酶活性和酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)測(cè)定研究發(fā)現(xiàn)：突變體較野生型而言，活性都有很明顯的下降，R142A和N600A兩