抗氯霉素單克隆抗體的制備及化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法的建立.pdf

1、氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一種廣譜抗生素,對(duì)人體有較強(qiáng)的副作用與毒性,會(huì)導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥,但因其價(jià)格便宜且性質(zhì)穩(wěn)定,養(yǎng)殖業(yè)中仍有違規(guī)使用的現(xiàn)象。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)具有靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。本研究制備了抗CAP單克隆抗體,并建立氯霉素化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。
　　 以琥珀氯霉素(HAP)和氯霉素為半抗原,牛血清白蛋白(BSA)為載體,分別采用混合酸酐法和重氮化法合成氯霉

2、素免疫抗原HAP-BSA、CAP-BSA,起始摩爾比分別為50:1、30:1、20:1。以卵清蛋白(OVA)為載體,采用活潑酯法(EDC-NFIS法)合成40:1～1:1七個(gè)不同起始摩爾比的ELISA檢測(cè)用包被抗原(HAP-OVA),紫外、紅外光譜掃描和SDS-PAGE電泳法鑒定全抗原偶聯(lián)成功,紫外測(cè)定HAP-BSA偶聯(lián)分別為27:1、18:1、8:1,CAP-BSA偶聯(lián)比分別為21:1、11:1、5:1,HAP-OVA偶聯(lián)比26:1～

3、1:3。
　　 將偶聯(lián)比為18:1的HAP-BSA,偶聯(lián)比為21:1的CAP-BSA各免疫6只Balb/c小鼠,每種抗原三個(gè)劑量梯度25、75、100μg/只,兩個(gè)平行。三免后以4＃HAP-OVA包被酶標(biāo)板,ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)及其對(duì)CAP的敏感性(通過(guò)CAP半數(shù)抑制濃度IC50值反映),最終選擇效價(jià)高、IC50值低的6＃小鼠沖擊免疫。利用雜交瘤技術(shù)將6＃小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,融合率為84.6％。

4、經(jīng)過(guò)亞克隆篩選出兩株產(chǎn)抗CAP單克隆抗體的細(xì)胞株,編號(hào)為ⅣlB3、Ⅳ2E7,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),用ELISA法檢測(cè)上清液中抗體效價(jià)與敏感性,選擇效價(jià)高、IC50值低的Ⅳ183株細(xì)胞注射小鼠腹腔,誘生腹水。辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行單克隆抗體純化。通過(guò)優(yōu)化選擇偶聯(lián)比為3:1的HAP-OVA為最佳包被抗原,此包被抗原下進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定單克隆抗體效價(jià)為2×105,IC50值為15ng/mL。經(jīng)鑒定,抗CAP單抗與青霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素藥物

5、幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng),與琥珀氯霉素的交叉反應(yīng)率為110.3％。
　　 采用混合酸酐法合成不同起始摩爾比的酶標(biāo)記抗原HAP-HRP,ELISA實(shí)驗(yàn)選出最佳酶標(biāo)記抗原。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了化學(xué)發(fā)光底物液各組分的最佳濃度,發(fā)光物質(zhì)為5×10-4 mol/L luminol,發(fā)光增強(qiáng)劑為4×10-4 mol/L對(duì)碘苯酚,氧化劑為3×10-3 mol/L H2O2溶液。通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)CLISA實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,確定了單克隆抗體包被濃度為1.5μg/mL

6、,HAP-HRP稀釋倍數(shù)為1000倍,標(biāo)準(zhǔn)品CAP(待測(cè)物)與HAP-HRP競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為30min。
　　 建立了氯霉素CLEIA分析方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=-130801gX+35091,線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.997(其中Y為RLU值,lgX為CAP對(duì)數(shù)濃度),該方法中CAP半數(shù)抑制濃度IC50為2.3ng/mL,檢測(cè)限為0.018ng/mL,檢測(cè)范圍為0.067ng/mL～36.7ng/mL,批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差<7％,批間標(biāo)準(zhǔn)偏差<10％