基于滾環(huán)擴增技術和納米材料的生物傳感新方法的研究.pdf

1、生命體中蛋白質、核酸、酶活性以及生物小分子活動信息的研究對生物醫(yī)學以及臨床診斷和治療有著非常巨大的意義。如何實時、動態(tài)、快速、準確地獲取這些生命活動的信息，就成為了分析化學科研工作者面臨的重大的挑戰(zhàn)。為了克服這個難題，就需要我們發(fā)展一些準確性高、靈敏度高以及特異性高的定性或定量的方法，達到獲取信息的目的。本論文瞄準上述挑戰(zhàn)進行研究，基于滾環(huán)擴增技術和納米材料發(fā)展了一系列分別以小分子、核酸、蛋白質和酶活性為檢測對象的高靈敏性高選擇性的生物

2、傳感技術，并通過對實際樣品的分析，初步驗證了這些技術的可行性和準確性。
　　第2章中，單個細胞中microRNA的空間分布和表達水平對于考察microRNA及其調控網絡的復雜性在生物學中的作用具有十分重要的意義。我們開發(fā)一種基于目標自引物等溫滾環(huán)擴增技術高靈敏高選擇性的原位檢測腫瘤細胞microRNA。該方法，首先利用改良的microRNA固定方法，將microRNA的5'端磷酸基團與細胞中蛋白質的氨基通過EDC共價交聯(lián)，達到固定

3、microRNA的目的。然后預先制備的DNA環(huán)狀探針與microRNA經過原位雜交，microRNA作為引物，在dNTPs和聚合酶的作用下進行滾環(huán)擴增反應，產生一條長的與環(huán)形DNA模板互補的單鏈DNA。細胞原位產生的擴增產物利用熒光染料標記的探針雜交識別，由于滾環(huán)擴增產物可以與成千上萬的熒光染料標記探針雜交，從而達到目標microRNA高靈敏的可視化的檢測。由于滾環(huán)擴增反應只能由microRNA游離的3'端觸發(fā)，因此從根本上消除了mRN

4、A以及microRNA前體的干擾。我們使用這種方法來實現(xiàn)人肝癌細胞SMMC-7721和人正常細胞株L02細胞中mir-222與mir-223表達水平的高靈敏的可視化檢測，并進一步實現(xiàn)了單個細胞中不同microRNA的同時檢測。我們認為目標觸發(fā)的基于目標自觸發(fā)滾環(huán)擴增原位檢測方法是可靠的研究疾病相關的microRNA表達分析方法，在基礎研究和臨床診斷上具有很大的應用潛力。
　　第3章中，DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，在

5、調節(jié)基因表達的過程中通過影響染色質結構，DNA構象、穩(wěn)定性以及與蛋白質相互作用方式等途徑來實現(xiàn)。DNA甲基化目前已成為多種腫瘤診斷的生物標志物。高靈敏高特異性的檢測CpG島DNA甲基化表型對于甲基化的研究和臨床診斷都具有非常重大的意義。在本章中，我們將滾環(huán)擴增技術與DNA為模板形成熒光特性的銀納米簇相結合發(fā)展了一種可用于實際體系中DNA甲基化檢測的方法。該方法首先將DNA經過亞硫酸鹽的處理，再利用EcoliDNA連接酶對錯配的堿基對高特

6、異性識別，在進行退火連接-變性解鏈的熱循環(huán)過程中，亞硫酸鹽處理后的甲基化的目標DNA與經過合適設計的與其具有完全互補堿基對的掛鎖探針雜交，通過連接酶的作用下產生連接產物，該連接產物自身具有發(fā)夾結構，并有完整的限制性內切酶識別位點。銀納米簇DNA模板作為引物，在具有強鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下自發(fā)啟動聚合酶延伸反應以及鏈置換的恒溫滾環(huán)放大反應，隨后在限制性內切酶的作用下，釋放出大量可以合成銀納米簇的DNA模板。在硝酸銀、硼氫化鈉的作

7、用下，產生熒光信號，從而可實現(xiàn)目標DNA甲基化的檢測。該方法設計巧妙新穎，有較高的靈敏度和選擇性，檢測限達6.4fM。
　　第4章中，基于鳥嘌呤可觸發(fā)DNA為模板合成銀納米簇熒光增強的性質發(fā)展了一種高靈敏檢測腫瘤細胞中端粒酶活性的分析方法。在該方法中，我們設計了一條包含合成銀納米簇模板的端粒酶擴增引物序列，未存在端粒酶的時候，此模板合成出熒光信號很弱的銀納米簇。在目標端粒酶的作用下，引物進行擴增，擴增出富含G堿基的TTAGGG重復

8、序列，此時合成銀納米簇不僅使得熒光信號有很大的增強，同時熒光發(fā)射波譜紅移。這種方法實現(xiàn)了對Hela細胞中端粒酶活性的高靈敏檢測，動態(tài)響應范圍為500到50000個細胞，并且在該范圍內峰熒光信號與HeLa細胞個數(shù)的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系，同時該方法具有較高選擇性，線性范圍寬，高靈敏度等優(yōu)點。
　　第5章中，基于核酸適配體探針可自組裝在二硫化鉬納米片的表面上形成穩(wěn)定的適配體-二硫化鉬納米片結構的生物傳感器，發(fā)展了一種高靈敏的蛋白質和生

9、物小分子的檢測新方法。修飾了熒光素的核酸適配體探針自組裝在二硫化鉬納米片的表面，依舊保持核酸適配體高的特異性和親和力。這種復合結構可以作為低背景的平臺用于ATP和凝血酶的檢測。當靶目標不存在時，熒光探針與MoS2發(fā)生熒光共振能量轉移，熒光被顯著淬滅。當靶目標存在的情況下，靶物質與核酸適配體結合具有高的特異性和親和力，誘導核酸適配體其形成更加剛性的分子結構，這種剛性結構的形成減弱了核酸適配體與MoS2的之間的范德華力作用，使得核酸適配體不

10、能被MoS2有效的吸附淬滅，適配體探針與靶目標結合脫離二硫化鉬納米片的表面，熒光恢復。該方法設計簡單、操作簡便、靈敏度高選擇性好，也可以通過靈活的使用不同的核酸適配體和DNA修飾上不同的熒光基團應用于生物醫(yī)學領域多組分物質的同時檢測。
　　第6章中，多聚核苷激酶(PNK)對DNA的磷酸化修飾過程在許多的生理活動中起著非常重要的作用。本章以T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4PNK)為模型，基于

11、磷酸化的DNA被特異性外切酶降解結合WS2獨特的吸附和淬滅性能發(fā)展了一種熒光方法用于T4PNK酶活性的測定。由于WS2與雙鏈DNA的結合力較弱不能有效淬滅染色雙鏈產物的熒光，因此得到較強的熒光信號。雙鏈DNA作為T4PNK的底物，當T4PNK作用之后，雙鏈DNA模板將被磷酸化，導致雙鏈DNA立即被λ核酸外切酶降解，產生得到的單鏈DNA被WS2強烈吸附同時淬滅其熒光。WS2的超強熒光淬滅能力也為該方法提供了有較寬的線性范圍和低的檢測限，其