埃博霉素補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝研究.pdf

1、粘細(xì)菌中的纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物埃博霉素是一類較新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。由于這類化合物具有抗真菌的性質(zhì)，最初它們是作為植物保護(hù)劑進(jìn)行研究。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)其對(duì)動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，表征為微管蛋白聚合劑，從而越來(lái)越引人注意?，F(xiàn)已知埃博霉素能發(fā)揮類似于紫杉醇的穩(wěn)定微管效應(yīng)進(jìn)而起到抗快速增殖細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞或其他多度增殖細(xì)胞的疾病的細(xì)胞毒活性作用。埃博霉素活性高于紫杉醇，對(duì)紫杉醇耐受及多藥抗性的癌細(xì)胞具有很好的抑制作用，而且埃博霉素具有較

2、紫杉醇簡(jiǎn)單的化學(xué)結(jié)構(gòu)和良好的水溶性，可通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)等特點(diǎn)，使得埃博霉素成為新一代抗腫瘤藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。然而，其產(chǎn)生菌纖維堆囊菌的合成水平較低，成為埃博霉素類藥物研發(fā)的主要限制。鑒于纖維堆囊菌的難操作性，國(guó)際上針對(duì)埃博霉素的生物合成改造多考慮在異源菌株中進(jìn)行，但是異源表達(dá)的困難在于：埃博霉素對(duì)異源宿主菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒性使異源表達(dá)產(chǎn)量極低。因此選擇對(duì)埃博霉素產(chǎn)生菌纖維堆囊菌進(jìn)行改造，以及對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化來(lái)獲得埃博霉素，仍是最有效的方

3、法。
　　本文以埃博霉素生產(chǎn)菌作為研究對(duì)象，對(duì)其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下的基本參數(shù)及50L發(fā)酵罐分批發(fā)酵條件下的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化并采用響應(yīng)面法對(duì)補(bǔ)料條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終通過(guò)發(fā)酵罐逐級(jí)放大試驗(yàn)，建立了一套高效的埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。在搖瓶發(fā)酵條件下研究了埃博霉素生產(chǎn)菌的生產(chǎn)基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù)，確定了纖維堆囊菌的快速生長(zhǎng)過(guò)程與還原糖的消耗過(guò)程相偶聯(lián)，而埃博霉素作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，其合成過(guò)程滯后于菌體的生長(zhǎng)過(guò)程，在

4、菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期大量合成。而氨基氮的消耗規(guī)律在發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)不明顯。據(jù)此而確立了一套以還原糖、生物量、埃博霉素產(chǎn)量為主要測(cè)定參數(shù)的工藝研究方法。搖瓶實(shí)驗(yàn)條件放大到發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，所得到的產(chǎn)物和產(chǎn)量往往有較大差別，特別是對(duì)培養(yǎng)環(huán)境極為敏感的纖維堆囊菌。發(fā)酵基本動(dòng)力參數(shù)也可能會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件的放大而產(chǎn)生變化。為了能夠向埃博霉素的大規(guī)模生產(chǎn)更進(jìn)一步，本實(shí)驗(yàn)又針對(duì)發(fā)酵罐分批發(fā)酵特點(diǎn)進(jìn)行初步研究，分析了甘油、丙酸鈉的補(bǔ)料條件對(duì)纖維堆囊菌的生長(zhǎng)及埃博

5、霉素產(chǎn)量的影響。最后采用響應(yīng)面法對(duì)甘油及丙酸鈉的補(bǔ)料濃度及補(bǔ)料時(shí)間進(jìn)行工藝優(yōu)化。建立最優(yōu)化的補(bǔ)料條件：在發(fā)酵的第4天補(bǔ)料10mg/L的甘油，0.4mg/L的丙酸鈉。在給定的條件下埃博霉素的產(chǎn)量增加了13.7％。補(bǔ)料條件建立之后，發(fā)酵過(guò)程條件的參數(shù)是否受到影響并做相應(yīng)變化便成為首先應(yīng)該研究的問(wèn)題。溫度和pH的變化對(duì)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的酶促反應(yīng)有很大影響，而接種量的多少則會(huì)影響到在發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的得率。實(shí)驗(yàn)對(duì)補(bǔ)料條件下的發(fā)酵溫