白花泡桐葉和莖的cDNA--SRAP差異表達分析.pdf

1、泡桐作為一種快速增長的經(jīng)濟林樹種，從屬于玄參科（Scrophulariaceae），原產(chǎn)于我國。其物種資源豐富，分布廣泛，在木材加工應用、生態(tài)觀賞及醫(yī)學應用研究方面有較高的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益。葉作為泡桐的重要器官，通過光合作用和呼吸作用為植株提供生長發(fā)育所需要的能量，同時儲存養(yǎng)分和有機物，對泡桐的生命活動起著重要的作用。研究葉在林木生長發(fā)育中基因表達的相關情況，為泡桐生長發(fā)育基因工程探索提供有效數(shù)據(jù)。cDNA-SRAP（cDNA-seq

2、uence-related amplified polymorphism）技術作為一種適用于差異表達分析的轉錄組分析技術，其操作簡便、試驗程序簡單，重復性強、試驗成本低，可以多個樣本間進行比較分析，在沒有己知序列的前提下，仍可進行差異比對分析，具有高頻共顯性標記。本試驗采用cDNA-SRAP技術嘗試對泡桐葉和莖進行差異分析，以期在基因表達層面上了解泡桐組織器官間差異及葉生長發(fā)育相關基因的表達情況，探索其可能在泡桐生長過程中的表達調控機制

3、。具體研究結果如下:
　　1)通過cDNA-SRAP分子標記技術方法的研究，以提取的白花泡桐RNA，經(jīng)過逆轉錄合成cDNA第一條鏈為反應模板，根據(jù)其技術原理，從64對設計的引物序列中篩選出25對擴增較好的適用于泡桐差異表達分析的引物組合。cDNA-SRAP反應體系總體積為25μL:10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,cDNA模板0.5μL,dNTP2.5mmol·L-11μL,Taq DNA polymerase5U·μL

4、-10.2μL，正向反向引物各0.5μL，雙蒸H2O19.8μL。PCR反應程序為:94℃預變性4min;94℃變性45s，36℃復性45s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán);72℃修復延伸10min，4℃終止反應保存。
　　2)通過對白花泡桐葉和莖在篩選出的25對引物下進行重復二次SRAP反應體系擴增中的差異片段進行分析，最終從中篩選出23條有明顯差異表達的條帶，片段長度主要在400～1700bp之間，兩次PCR擴增重復率為

5、66.8％，其中6條在葉中單獨表達，15條與莖相比高表達。將差異條帶進行切膠回收、并進行克隆測序，在NCBl系統(tǒng)中進行BLASTX同源性比對分析，其中有近70％的差異片段測序結果與已知蛋白序列有較高的同源性，包含能量與代謝、蛋白質合成、細胞壁相關、信號傳導與脅迫響應及復合影響等多個方面。
　　3)選取差異片斷對其進行實時熒光定量PCR分析，驗證cDNA-SRAP結果的準確性，運用相對定量分析方法及2-(ΔΔCt)計算方法，選取管家