紅色紅曲菌交替氧化酶基因Mraox1克隆與功能初步研究.pdf

1、在高等植物,大部分真菌和一些原生動物中存在2條電子呼吸鏈:細胞色素途徑和交替途徑。交替途徑對氰化物不敏感,因此該途徑又被稱為抗氰途徑,交替氧化酶是交替途徑的末端氧化酶。交替途徑與細胞色素途徑在泛醌處分支,由交替氧化酶催化,泛醌將電子直接傳遞給氧化生成水,釋放熱量,不產生ATP。
　　 本研究從紅色紅曲菌(Monascus ruber)M-7中克隆得到了交替氧化酶基因(alternative oxidase from Monasc

2、us ruber,Mraoxl),及其上下游部分序列,構建了Mraoxl的敲除載體。通過農桿菌介導,將敲除載體轉入紅曲菌M-7,篩選得到一株ΔMraoxl突變子,并對這一株突變子進行了抗逆性分析和表達調控的初步分析。具體結果如下:
　　 1.Mraoxl基因的克隆及序列分析
　　 根據已報道的aox基因的核酸序列和其編碼的氨基酸序列,設計了簡并引物,擴增得到了Mraoxl基因的一段DNA序列。在此基礎上,采用SON-PC

3、R獲得了Mraoxl基因的編碼區(qū)及其上游和下游部分序列共4223bp,包括開放讀碼框1198bp,5’非編碼序列2329bp和3’非編碼序列696bp。經軟件分析和預測,Mraoxl基因的開放讀碼框包含3個外顯子和2個內含子。預測編碼序列上游含有一個CRE-like元件和兩個鋅指蛋白結合位點。MraoxJ基因共編碼350個氨基酸。其氨基酸序列與其他絲狀真菌的AOX序列有很高的相似性,含有與雙鐵中心形成有關的EXXH和EEE-Y保守域。軟

4、件預測Mraoxl基因的編碼氨基酸序列的N端的59個氨基酸為線粒體轉運肽。
　　 2.Mraoxl基因的敲除
　　 以潮霉素抗性基因(hph)為篩選標記,構建Mraoxl基因的敲除載體,采用農桿菌介導轉化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),對紅曲菌M-7進行了兩次轉化,獲得205株轉化子。通過對140株轉化子進行經PCR篩選和southern

5、雜交驗證,分離得到一株ΔMraoxl突變子。
　　 3.Mraoxl功能的初步分析
　　 3.1 H2O2、高溫、pH值和滲透壓對ΔMraoxl和M-7的孢子萌發(fā)率的影響
　　 為分析Mraoxl是否參與環(huán)境應激過程,將105個/mL的△Mraoxl和M-7的孢子液進行H2O2、高溫、不同pH值和滲透壓的處理,分析它們孢子萌發(fā)率的變化。10、20和30mmol/L的H2O2水溶液處理5h后,△Mraoxl的孢子萌

6、發(fā)率較M-7分別低49％、42％和25％。40℃和50℃水浴處理1、2和3h后,ΔMraoxl的孢子萌發(fā)率均低于M-7,其中40℃處理2h時,差異值達到最大,為18％。經pH8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液處理2、4和6h后,△Mraoxl突變子的孢子萌發(fā)率較M-7低,其中處理4h時,差異最大,為29％。經0.2、0.5和0.8mol/L的NaCl溶液處理之后24h后,△Mraoxl與M-7的孢子萌發(fā)率無顯著差異。綜合以上實驗結果,推測