實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)奶制品摻假方法研究.pdf

1、目的：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立奶制品中主成分牛、羊及其常見摻假成分谷類、大米、大豆源性成分的定性檢測(cè)體系,以鑒別檢測(cè)奶制品相關(guān)摻假;并在定性的基礎(chǔ)上探索奶粉中牛源性主成分的定量檢測(cè)方法。
　　方法：⑴奶制品摻假定性檢測(cè)體系研究:分別以牛的線粒體細(xì)胞色素 b基因、羊的線粒體12SrRNA基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)合成牛、羊源性引物探針,以常見摻加物大米、玉米、小麥、高粱、大麥等谷物的葉綠體rbcL基因作為靶基因通過BLAST軟件比對(duì)選擇其同

2、源保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成谷類通用性引物探針、以水稻的根部表達(dá)基因(gos9)設(shè)計(jì)合成大米特異性引物探針、以大豆凝集素基因(lectin)為靶基因設(shè)計(jì)合成大豆特異性引物探針,建立奶類摻假實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系。經(jīng)對(duì)目標(biāo)成分與奶制品中常添加的非目標(biāo)成分檢測(cè)以驗(yàn)證其通用性和特異性,用10倍倍比稀釋的目標(biāo)成分的DNA模板檢驗(yàn)其靈敏度,以自制模擬奶類樣品檢測(cè)其在模擬樣品檢測(cè)中的靈敏度及抗干擾能力,并進(jìn)一步經(jīng)市售奶類樣品檢測(cè)驗(yàn)證其應(yīng)用檢測(cè)能力。⑵奶粉中牛

3、源性主成分定量研究:采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以牛的線粒體細(xì)胞色素b基因?yàn)榘谢蚪⒉煌|(zhì)量百分比的牛奶粉標(biāo)準(zhǔn)品中的主成分含量與相應(yīng)Ct值間的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出奶粉中主成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。經(jīng)回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)該方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估,并將其用于市售嬰幼兒奶粉樣品的檢測(cè)以驗(yàn)證其可行性。
　　結(jié)果：①所建立的牛、羊源性主成分定性檢測(cè)體系在35個(gè)循環(huán)之內(nèi)只有目標(biāo)成分出現(xiàn)陽性擴(kuò)增,而與其他非目標(biāo)成分均無交叉擴(kuò)增,特異性好。靈敏度分別為0

4、.1ng、0.01ng的模板DNA,1％(w/w)、0.5％(w/w)的模擬樣品。進(jìn)一步經(jīng)市售樣品檢測(cè)驗(yàn)證,只對(duì)含目標(biāo)成分的奶制品擴(kuò)增陽性,檢測(cè)結(jié)果均與食品標(biāo)簽相符。②所建立的谷類通用檢測(cè)體系在35個(gè)循環(huán)內(nèi),大米、大豆源性檢測(cè)體系在40個(gè)循環(huán)內(nèi),只針對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行擴(kuò)增,與其它非目標(biāo)成分均無交叉擴(kuò)增,通用性和特異性好,靈敏度分別為0.01ng、0.1ng、0.1ng的目標(biāo)DNA,0.5％(w/w)、0.1％(w/w)、0.5％(w/w)的

5、模擬樣品,進(jìn)一步經(jīng)市售奶類樣品檢測(cè)驗(yàn)證,1份樣品被檢測(cè)出含大豆成分,其它結(jié)果均與食品標(biāo)簽相符。③奶粉中牛源性主成分定量研究:本研究建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-0.057x+32.759,相關(guān)系數(shù)R為0.964,回收率在109％~134％之間,8份市售奶粉樣品中檢測(cè)出3份樣品的牛奶含量低于50％,該3份樣品進(jìn)一步經(jīng)谷類、大米、大豆定性檢測(cè)體系檢測(cè),證實(shí)其中有1份樣品被非法摻入了非大米谷類源性成分而另2份樣品中未檢測(cè)出非法摻入谷物、大米