吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉氨酶的活化機理研究.pdf

1、谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase，EC2.3.2.13，簡稱TGase）能催化蛋白質分子內、分子間發(fā)生酰基轉移反應，從而改變蛋白質結構和功能特性，在食品、生物醫(yī)藥、組織工程、紡織等領域具有廣泛的應用前景。鏈霉菌TGase是酶原(Pro-TGase)經(jīng)活化而成的，但是關于鏈霉菌TGase的活化機理還不清楚。為了深入地研究吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)產(chǎn)TGase的活化機理，本論文對S．h

2、ygroscopicus發(fā)酵產(chǎn)生的Pro-TGase和TGase的高效分離純化及TGase的活化過程進行了研究。主要研究結果如下：
　　 1．在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的Cu2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e2+,Co2+五種金屬離子，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Cu2+，Mn2+,Zn2+對S．hygroscopicus產(chǎn)TGase有明顯的促進作用，并且確定0.05 mmol/LCu2+是最適合添加的離子。確定了S．hygroscopicu

3、s利用優(yōu)化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)60h時Pro-TGase可以完全轉化成TGase。
　　 2．利用硫酸銨沉淀和陰離子交換層析以及凝膠過濾層析對S．hygroscopicus發(fā)酵上清液中的Pro-TGase和TGase進行了高效分離純化，并得到兩種活性較高而電荷量不同的TGase(TGaseA和TGaseB)。本研究是首次利用陰離子交換層析法對吸水鏈霉菌Pro-TGase和TGase分離純化。
　　 3．通過Hipr

4、ep1610 phenyl FF柱和LC-MS以及CD譜對兩種TGase的疏水性、天然相對分子質量以及二級結構進行分析，發(fā)現(xiàn)TGase A和TGase B的疏水性、相對分子質量和二級結構均存在差異。研究了兩種TGase的動力學，發(fā)現(xiàn)兩種TGase的Vmax、Km和kcat差異也很大。
　　 4．測定了S． hygroscopicus來源的Pro-TGase的N端氨基酸序列為ASGGDG，TGase A和TGase B的N端前五個

5、氨基酸序列均為DAADE。S．hygroscopicus來源Pro-TGase的N端氨基酸序列與已報道的S． cinnamoneus、S．fradiae、S．netropsis來源的相似性很高，但TGase的N端序列與這三種鏈霉菌來源的相似性卻不高。本研究是首次對S．hygroscopicus來源的TGase的N端氨基酸序列進行報道。
　　 5．對純化后的Pro-TGase與TGase A和TGase B的相互作用進行研究發(fā)現(xiàn)，

6、Pro-TGase可以被自身的TGase B活化但不能被TGase A活化。熱處理后的Pro-TGase對TGase A和TGase B的活性均有抑制作用，而且對TGase B的抑制作用更顯著。本研究是首次對S． hygroscopicus來源的Pro-TGase可以被自身的TGase活化進行報道。
　　 6．分別對不同培養(yǎng)時間點的發(fā)酵液進行分離純化，發(fā)現(xiàn)了TGase的活化機理：S．hygroscopicus經(jīng)過24h的培養(yǎng)后P