基于基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的銀納米粒子細(xì)胞毒性機(jī)理研究.pdf

1、銀納米粒子由于小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)顯著增強(qiáng)，其殺菌能力相比傳統(tǒng)含銀抗菌材料產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍，是一種具有廣譜高效抗菌性能的新型納米生物材料，近幾年來在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域獲得了非常廣泛的應(yīng)用。然而，由于目前還未形成納米材料安全性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)體系，隨著越來越多的納米銀生物材料投入市場，納米銀的毒性作用及其機(jī)理研究逐漸引起了廣大科研工作者的關(guān)注。一些研究報(bào)道顯示，納米銀對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，但細(xì)胞毒性機(jī)理尚不明朗。
　　 本論文的研究目的

2、是在銀納米粒子與細(xì)胞相互作用的檢測基礎(chǔ)上，采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，在基因表達(dá)水平上研究銀納米粒子對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性機(jī)理，并為在分子水平上建立基于基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的生物材料與細(xì)胞相互作用機(jī)理的研究方法打下基礎(chǔ)。
　　 本論文的具體工作如下：
　　 1.通過流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)對(duì)200μM，20 nm納米銀作用HDF-f細(xì)胞1、4、8 h后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，納米銀作用后，細(xì)胞

3、可能出現(xiàn)DNA損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯；與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比，納米銀作用后，細(xì)胞凋亡率沒有發(fā)生顯著變化，而8h的凋亡率在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中相對(duì)最高，表明納米銀誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能隨著時(shí)間變化逐漸顯現(xiàn)。
　　 2.以正常培養(yǎng)的HDF-f細(xì)胞作為正常對(duì)照組，200μM，20 nm納米銀處理1、4、8 h后的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，采用Illumina公司的全基因組表達(dá)譜芯片Human-6 V3 Expression BeadChip Array進(jìn)

4、行了基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)，篩選出了三個(gè)時(shí)間點(diǎn)不重復(fù)的共計(jì)1593個(gè)差異表達(dá)基因；通過熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了芯片實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。
　　 3.應(yīng)用Cluster&TreeView軟件對(duì)200μM，20 nm銀納米粒子作用HDF-f細(xì)胞1、4、8h后的差異表達(dá)基因進(jìn)行了層次聚類，獲得了具有不同表達(dá)模式的五個(gè)基因簇；應(yīng)用DAVID功能注釋工具對(duì)五種表達(dá)模式的基因簇分別進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，Go）注釋分析

5、，得到了不同表達(dá)模式中所含基因在GO功能中的不同分布情況，對(duì)基因表達(dá)水平上銀納米粒子對(duì)HDF-f細(xì)胞作用情況的時(shí)序性變化進(jìn)行了初步分析；應(yīng)用GoSurfer軟件分析了差異表達(dá)基因在GO生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分三個(gè)層次的功能分布情況，獲得了比較全面的差異表達(dá)基因的GO功能分布概況；
　　 4.應(yīng)用GenMAPP軟件對(duì)200μM，20 nm銀納米粒子作用HDF-f細(xì)胞1、4、8 h后的差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)途徑（Pathwa

6、y）進(jìn)行分析。在GenMAPP數(shù)據(jù)庫中找到的差異表達(dá)基因共有396個(gè)，共得到包含差異表達(dá)基因的MAPPs90個(gè)，對(duì)其中14個(gè)MAPPs代表的生物學(xué)途徑進(jìn)行了詳細(xì)討論。
　　 5.應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析平臺(tái)對(duì)200μM，20 nm銀納米粒子作用HDF-f細(xì)胞1、4、8 h后的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。IPA根據(jù)每個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的基因關(guān)聯(lián)程度對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行打分，對(duì)打分最高的前5個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行具體分析。<

7、br>　　 6.綜合聚類、GO分析、生物學(xué)途徑分析和基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果，對(duì)銀納米粒子與細(xì)胞相互作用的分子機(jī)理進(jìn)行總結(jié)，得到了銀納米粒子的細(xì)胞毒性機(jī)理的初步解釋。將本論文的研究結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行了比較和討論，發(fā)現(xiàn)本論文獲得的結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道存在一致性，說明本論文的技術(shù)路線可以在一定程度上與傳統(tǒng)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)可以互為補(bǔ)充與印證，并且更為高效，更容易獲得整體的細(xì)胞毒性機(jī)理解釋。另外，與同樣利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道