基于納米材料新型電化學傳感器的制備及其在生物樣品分析中的應用研究.pdf

1、電化學生物傳感器結合了信息技術與生物技術，涉及化學、生物學、物理學以及電子學等學科。由于其具有體積小、分辨率高、響應時間短、所需樣品少、對活細胞損傷小等特點，電化學生物傳感器在醫(yī)藥工業(yè)、食品檢測和環(huán)境保護等諸多領域有著廣闊的應用前景。近年來，隨著材料科學、化學、物理學等學科的發(fā)展，納米材料因具有特殊的結構效應，如小尺寸效應、表面界面效應、量子尺寸效應、宏觀量子隧道效應及介電限域效應等，使其在許多領域得到了廣泛應用。目前，采用納米材料構建

2、新型的電化學生物傳感器日益成為研究熱點。納米材料應用于電化學生物傳感器領域后，不僅提高了傳感器的檢測性能，而且使傳感器的化學和物理性質以及它對生物分子或者細胞的檢測靈敏度大幅提高，檢測時間也得以縮短，并且可實現(xiàn)高通量的實時分析檢測。
　　 本論文的工作主要集中在將納米技術和電化學傳感技術相結合，開發(fā)了基于納米材料的新型電化學生物傳感器并將其用于檢測水體中大腸桿菌和細胞表面的多聚糖。該傳感技術為水體中大腸桿菌的快速檢測提供了新方法

3、，同時也為腫瘤疾病的早期診斷及治療提供了新途徑。具體研究內容如下：
　　 第-部分：Cu@Au復合納米粒子標記抗體的電化學免疫方法用于水體中大腸桿菌的快速檢測
　　 本文制備了Ca@Au復合納米粒子，并將其用于標記大腸桿菌抗體，利用電化學免疫技術實現(xiàn)了對水體中大腸桿菌的快速檢測。Cu@Au復合納米粒子具有優(yōu)良的生物相容性、電化學活性和穩(wěn)定性。與單獨的金納米顆粒相比，Cu@Au復合納米粒子作為抗體標記物大幅提高了電化學檢測

4、的靈敏度。在實驗過程中，首先將大腸桿菌吸附在聚苯乙烯修飾的ITO導電玻璃表面，利用抗體和大腸桿菌之間的免疫反應把Cu@Au復合納米粒子標記的抗體結合在ITO導電玻璃表面。將Cu@Au復合納米粒子在溴氫酸中氧化為離子形式，然后用陽極溶出伏安法定量檢測溶液中的Cu2+。為了提高檢測靈敏度，采用Nafiob/貢膜修飾的玻碳電極(GCE/Nafion/Hg)作為工作電極，Cu2+的檢測限可達9.0×10-12 M。結果表明，在50 cfu/mL

5、～5.0×104 cfu/mL濃度范圍內，銅的響應電流與大腸桿菌濃度的對數(shù)呈線性關系，檢測限為30 cfu/mL，總的分析時間為2 h。將研究的電化學免疫方法用于地表水中大腸桿菌的測定，通過對實際水樣進行預富集，能夠檢測到大腸桿菌的濃度為3 cfu/10 mL。
　　 第二部分：基于磁性高分子微球的電化學DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測
　　 本文研制了一種新型的基于磁性高分子微球的電化學DNA生物傳感器，并將其

6、用于水體中大腸桿菌的檢測。以海藻酸包裹鈷的磁性高分子微球作為DNA探針的固體基質，根據(jù)大腸桿菌細胞體內甜uid A基因合成了特異性的DNA序列，制備了用于大腸桿菌檢測的DNA探針。利用透射電鏡技術對制備的磁性高分子微球進行了表征，并通過紅外光譜法證實了特定DNA序列與磁性高分子微球的成功連接。在DNA雜交前后，分別對嵌入式雜交指示劑柔紅霉素進行電化學測定，根據(jù)電化學信號的變化對目標DNA進行檢測。采用非互補DNA序列、三個堿基錯配的DN

7、A序列及完全互補DNA序列驗證了DNA探針的選擇性。實驗過程中利用聚合酶鏈反應(PCR)技術提取了大腸桿菌細胞體內uid A基因片斷，并用電化學DNA生物傳感器對經(jīng)過熱處理后的PCR產(chǎn)物和水體中大腸桿菌進行了測定。結果表明，本文研制的電化學DNA生物傳感器可以檢測到0.30 nM完全互補DNA序列和0.50 ng/μL的PCR產(chǎn)物，對大腸桿菌的檢出限為50 cfu/mL。
　　 第三部分：基于二茂鐵修飾氧化鋅納米棒的信號放大策略

8、用于水體中大腸桿菌的電化學免疫檢測
　　 本文將大腸桿菌檢測抗體(dAb)和二茂鐵(Fc)共同修飾于氧化鋅納米棒(ZnO NRs)表面制備了{dAb-ZnO-Fc}生物復合物，并將其用于水體中大腸桿菌的電化學免疫檢測。采用BCA蛋白測定法(BCA protein assay)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)分別對檢測抗體和二茂鐵在氧化鋅納米棒上的最優(yōu)配比進行了研究。該生物復合物利用二茂鐵作為電活性物質產(chǎn)生電信號

9、，檢測抗體用于免疫結合大腸桿菌。采用“三明治”夾心結構，首先將捕獲抗體固定在巰基乙酸修飾的金電極表面，然后通過免疫反應結合大腸桿菌，進而吸附{dAb-ZnO-Fc)生物復合物，最后用示差脈沖伏安法測定固定在電極表面上的二茂鐵。通過分析檢測不同濃度大腸桿菌溶液獲得的電流信號，從而實現(xiàn)了對大腸桿菌的定量檢測。實驗結果表明，在1.0×102 cfu/mL～1.0×106 cfu/mL濃度范圍內，二茂鐵的電流信號與大腸桿菌濃度的對數(shù)呈線性關系，

10、檢出限為50cfu/mL。通過對實際水樣進行富集濃縮，該電化學免疫技術可以檢測到5 cfu/10mL大腸桿菌。
　　 第四部分：巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器用于活體腫瘤細胞表面多聚糖的競爭檢測
　　 本文合成了巰基糖衍生物用于構建電化學生物傳感器，采用競爭策略檢測活體腫瘤細胞表面多聚糖的表達水平。該傳感器利用納米金/碳納米管修飾玻碳電極(GCE/MWNT/AuNP)為基底，通過Au-S鍵固定巰基糖衍生物。此外，采

11、用碳納米管為載體固定辣根過氧化酶(HRP)和刀豆球蛋白(Con A)制備了{ConA-MWNT-HRP}生物復合物。以人體肺、肝、前列腺組織中活體腫瘤細胞表面甘露糖為研究對象，利用甘露糖和刀豆球蛋白的特異性結合，傳感器表面的巰基糖衍生物與細胞表面的甘露糖競爭結合{Con A-MWNT-HRP}生物復合物。以對苯二酚為電子媒介體，通過測定辣根過氧化酶催化過氧化氫產(chǎn)生的響應電流對活細胞表面的多聚糖進行檢測。結果表明，在優(yōu)化的實驗條件下，本方

12、法用于腫瘤細胞的定量檢測具有寬的線性范圍和低的檢測限。同時，我們計算了每個細胞表面甘露糖的數(shù)目：每個肺癌細胞A549含有甘露糖的數(shù)目為5.8×1010個，每個肝癌細胞QGY-7703含有甘露糖的數(shù)目為1.3×1010個，每個前列腺癌細胞LNCaP含有甘露糖的數(shù)目為1.9×1010個。本文所研制的巰基糖衍生物功能化的電化學生物傳感器用于甘露糖的測定具有靈敏度高、選擇性好、響應信號快等優(yōu)點，為活細胞表面多聚糖的檢測提供了新的方法。
　

13、　 第五部分：凝集素電化學生物傳感器用于活體腫瘤細胞表面多聚糖的檢測研究
　　 本文制備了一種高靈敏度和高選擇性的凝集素(lectins)生物傳感器并將其用于檢測甘露糖(mqnnose)和唾液酸(sialic acid)在人體肺、肝、前列腺組織中正常細胞和腫瘤細胞表面的表達水平。采用碳納米管/納米金(MWNT/AuNP)修飾電極固定凝集素，利用細胞表面的多聚糖(glycans)和凝集素之間的特異性相互作用將細胞吸附在傳感器表面

14、，然后結合硫堇(Th)包被金納米粒子標記的凝集素{lectin-Au-Th}構建“三明治”夾心結構。最后用示差脈沖伏安法(DPV)定量檢測硫堇，實現(xiàn)了對細胞表面多聚糖的測定。實驗結果表明，甘露糖在正常細胞和腫瘤細胞表面的表達水平普遍較高；唾液酸在腫瘤細胞表面的表達水平要明顯高于其在正常細胞表面的表達，研究結果對于揭示腫瘤細胞的生物學行為具有一定的指導意義。同時，依據(jù)腫瘤細胞表面唾液酸與接骨木凝集素(SNA)的特異性相互作用，將該電化學生