聚乳酸—己內酯乳液靜電紡組織工程支架的制備及性能評價.pdf

1、靜電紡絲技術利用靜電場力來形成超細纖維，是目前制備納米纖維最為便捷的技術之一。納米纖維比表面積大，可以形成多孔的纖維支架，并且可以由多種具有良好生物相容性的高聚物制得，這使得納米纖維在很多方面有得天獨厚的應用。在作為組織工程支架方面，靜電紡超細纖維也顯示出其優(yōu)勢。在形態(tài)上，靜電紡纖維支架可以極大程度地模擬細胞外間質，為細胞的粘附、增殖及分化提供了必要條件;在功能上，靜電紡纖維支架可以作為藥物儲存和釋放的載體。但是，常規(guī)的靜電紡絲方法在作

2、為藥物載體方面具有其局限性。大多數(shù)的靜電紡絲方法采用將藥物和紡絲溶液混溶的方法將藥物包覆在超細纖維內，這將導致兩種不良后果:(1)如果藥物與紡絲溶液的親疏水性能相反（例如，親水的蛋白藥物與疏水的聚乳酸高聚物溶液）的話，就會形成不均勻的藥物溶液，導致藥物在纖維內的不均勻分布，不利于藥物釋放的控制;(2)對于一些具有生物活性的藥物（例如生長因子），簡單地將其與高聚物溶液混合很容易導致藥物失活或者聚集，這樣的藥物釋放至患處，不僅發(fā)揮不到積極的

3、治療作用，而且還有可能被身體識別為異體而發(fā)生免疫排斥反應，對患者非常有害。
　　針對上述問題，課題采取了乳液靜電紡方法來制備組織工程支架，研究工作分為三個部分:
　　(1)乳液靜電紡絲系統(tǒng)的建立
　　將模型蛋白藥物牛血清白蛋白(BSA)溶解于水溶液中，有機高聚物聚乳酸-己內酯(PLCL)溶解于有機溶劑氯仿中，將兩相溶液制備成為均勻的乳液作為紡絲液。通過共聚焦顯微鏡(LSCM)對包覆有熒光物質納米纖維的觀察，證實了所制得

4、的纖維為皮芯結構。通過測定纖維支架的水接觸角來評定其親水性能，常規(guī)靜電紡PLCL纖維與乳液靜電紡PLCL_BSA纖維的水接觸角分別為135.10°和89.30°，這表明乳液靜電紡絲纖維的親水性能得到了明顯的提高，這對后期細胞的吸附以及細胞行為都是有利的。藥物BSA的體外釋放結果表明，在長達28天的釋放實驗中，只有47.71％的BSA被釋放出來，該結果表明，所制備的乳液靜電紡載藥纖維能有效地抑制藥物的突釋現(xiàn)象，達到了長期釋放的效果。細胞增

5、殖實驗表明，在7、14和21天，與PLCL纖維支架相比，PLCL_BSA上的細胞增殖分別高出41.8％、85.0％和49.7％。實驗結果證實了乳液靜電紡纖維具有較好的生物相容性，與常規(guī)靜電紡方法所制備的纖維支架相比更加有利于支持細胞的貼附和增殖。
　　(2)擔載單藥物生長因子的乳液靜電紡納米纖維支架的制備及性能表征
　　利用血管內皮細胞生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)取代第

6、一部分工作中的模型蛋白藥物牛血清白蛋白(BSA)，并進行紡絲實驗，對所制備的纖維支架中纖維的皮芯結構、親水性能、拉伸性能等進行表征，并且通過細胞增殖MTS實驗驗證包覆有VEGF的靜電紡絲支架的生物相容性。VEGF的釋放試驗分為兩組，一組為利用葡聚糖（Dextran）水溶液作為VEGF的保護劑，記作PLCL-VEGF-DEX;另一組利用BSA水溶液作為保護劑，記作PLCL-VEGF-BSA。兩組均收到了良好的釋放效果，極大地抑制了初始突釋

7、現(xiàn)象。但是保護劑葡聚糖和牛血清白蛋白的選用會明顯地影響初始24小時內藥物的釋放，其釋放量分別為1.0％和9.6％;在之后的640小時，二者間的區(qū)別不明顯，分別為11.6％和11.7％。細胞增值實驗MTS結果說明，同純PLCL支架（常規(guī)靜電紡纖維支架）相比，含有VEGF的支架極大促進了增殖效果，在細胞培養(yǎng)第10天和第20天時，相比于純PLCL纖維支架，PLCL-VEGF-BSA纖維支架上的細胞增殖分別高出32.3％和49.9％;PLCL-

8、VEGF-DEX纖維支架上細胞增殖分別高出14.6％和39.8％。實驗結果同時也表明，經過靜電紡溶液配制和紡絲加工后，VEGF依然保持有明顯的活性。
　　為了進一步提高纖維支架的生物相容性，提高對VEGF的保護及擔載效果，在皮芯結構的纖維的芯層采用了天然高聚物明膠(Gelatin)來擔載VEGF，記作PLCL/GV。為了考察該纖維支架在支持間充質干細胞向心肌細胞方向分化上所起的作用，通過5-氮胞苷(5-AZA)處理的方法在此纖維支

9、架上進行了誘導人間充質干細胞向心肌細胞方向分化的實驗。在第10天、第15天與第20天時，PLCL/GV纖維上的細胞增殖情況與純PLCL支架相比，分別高出35.5％，61.1％和73.4％。從細胞增殖情況來看，5-氮胞苷處理對纖維支架上細胞的增殖情況沒有顯著影響。實驗結果說明:由于VEGF的抗細胞凋零作用，PLCL/GV纖維支架可以有效減少由于5-氮胞苷帶來的細胞凋零，實驗結果同時也驗證了擔載在纖維芯層的VEGF具有良好的生物活性。纖維支

10、架上的細胞形態(tài)通過5-氯熒光雙乙酸鈉染色(CMFDA)實驗來評價?？梢钥闯?，細胞尺寸變大，并且呈現(xiàn)出多邊形形態(tài)，并且與臨近的細胞互相接觸。生長在PLCL/GV支架上的細胞與生長在純PLCL支架上的細胞從數(shù)量到形態(tài)都有明顯區(qū)別。PLCL/GV納米纖維上的細胞更多地呈現(xiàn)出心肌細胞表型，這些細胞尺寸變大，形狀有所改變，彼此之間接觸并且形成了網絡。未分化的間充質干細胞形態(tài)細長，彼此平行，類似于成纖維細胞形狀。肌動蛋白和重鏈肌球蛋白兩次染色實驗均

11、說明PLCL/GV上的細胞表達出了更多的心臟特異性蛋白。
　　(3)擔載雙因子的乳液靜電紡納米纖維的制備及性能表征
　　利用乳液靜電紡纖維的皮芯結構特性，制備了皮層擔載有羥基磷灰石(HA)、芯層擔載有層黏連蛋白(Laminin)的乳液靜電紡纖維支架，記作PLCL/HA/Lam，并且在纖維支架上進行了成骨細胞的培養(yǎng)。MTS細胞增殖實驗顯示，從第7天開始，靜電紡纖維支架上細胞的增殖情況優(yōu)于組織培養(yǎng)板(TCP)。從第7天到第21天

12、，PLCL/HA/Lam纖維支架上的細胞增殖情況優(yōu)于其它支架。譬如21天時，與TCP、PLCL/HA（皮層擔載羥基磷灰石的單藥物纖維支架）和PLCL/Lam（芯層擔載層黏連蛋白的單藥物支架）相比，分別高出23.3％、12.0％和10.4％。在第14天和第21天，PLCL/HA/Lam纖維支架上的堿性磷酸酶活性顯著高于PLCL/HA和PLCL/Lam纖維支架(p≤0.05)，這是由于羥基磷灰石和層粘連蛋白的協(xié)同作用效果。EDX給出的數(shù)據(jù)在