生長激素釋放肽的固相合成.pdf

1、重組人生長激素(rhGH)在臨床有著十分廣闊的應用前景,在肯定rhGH療效的同時,出現(xiàn)的抗體形成、胰島素耐受、甲狀腺機能減退、價格昂貴、長期注射不便等問題也引起了人們的關注[1]。因此,研究人員積極尋找更簡便、更有效的能夠促進垂體生長激素分泌的藥物。1982年,研究人員在腦啡肽類似物結構的基礎上合成了第一個對生長激素分泌有刺激效應的非天然生物活性肽,此肽由6個氨基酸組成,其中包含兩種D型氨基酸,稱為生長激素釋放肽-6(Growth ho

2、rmone releasing peptide-6, GHRP-6)[2]。隨后幾年,研究組又在 GHRP-6的基礎上合成了七肽的GHRP-1和六肽的GHRP-2,這兩種活性肽刺激生長激素分泌的作用較GHRP-6更強[3-4]。這幾種 GHRP除了有較強的促進生長激素釋放的作用外,GHRP對心血管功能、攝食、脂肪細胞分化、胃酸分泌和胃腸運動的調節(jié)等作用也引起了人們注意,尤其是 GHRP對心臟功能多方面的調節(jié)和改善作用成為近年來研究的熱點

3、[5]。GHRP沒有物種專一性,在動物體內具有促進生長激素釋放、刺激動物食欲、促進動物生長、影響動物生產性能和提高動物免疫水平等多方面的功能,GHRP的研究發(fā)展對畜牧業(yè)生產也具有十分重要的意義[6]。
　　目前,國內外對 GHRP的作用機制、生理作用等進行了大量的理論和實踐研究,國內在上世紀90年代已有Boc固相合成策略合成GHRP-6的報道[7]。近來研究多集中在GHRP藥理研究上,在此基礎上,探索GHRP的合成方法,優(yōu)化合成工

4、藝,降低合成成本,成為越來越重要的課題。GHRP通過大量的結構改造而來,含有多種芳香族氨基酸,其序列中的D型氨基酸能夠有效地抑制蛋白酶的識別和水解,使其各種給藥途徑的利用率比其他肽類藥物都高,對維持多肽的生物活性起著重要作用[8]。本課題采用Fmoc固相合成策略,以Rink Amide-AM樹脂為載體,選擇碳二亞胺型縮合試劑DIC,在活化中添加HOBt試劑減少消旋副反應,逐步縮合完成接肽反應,通過幾種不同的切割試劑將粗肽從樹脂上切割下來

5、,比較其切割效果。粗肽經半制備高效液相色譜儀分離純化,再冷凍干燥得到最終產物。得到的純肽用 RP-HPLC進行純度分析,ESI-MS進行結構分析鑒定。
　　目的:
　　采用Fmoc固相多肽合成方法合成GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2三條短肽,探索影響產物結果的合成條件、切割條件和純化方法;確立產物的檢測方法;降低合成成本,得到純度較高的目標產物。
　　方法:
　　1 GHRP的固相合成
　　以Fmo

6、c固相合成方法分別合成GHRP-6、GHRP-1與GHRP-2。以合適的樹脂為載體,選擇能夠產生較低消旋率的縮合試劑,控制投料摩爾比和反應時間,規(guī)范操作,減少接肽反應過程中產生的副產物;通過茚三酮檢測反應的顏色變化判斷接肽過程中氨基酸的連接程度;探索樹脂替代度對合成反應的影響。
　　2 GHRP的切割、純化
　　根據氨基酸不同的保護集團,選擇不同的切割試劑配方,進行平行實驗;優(yōu)化切割條件,選擇簡便、副反應較少的切割方法;切割

7、下來多肽經過冰乙醚沉淀,離心收集產物得到粗肽;采用半制備型RP-HPLC分離純化;簡單處理純化后產物后經冷凍干燥得到最終產品。
　　3 GHRP的結構分析鑒定
　　通過RP-HPLC對合成的GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2的保留時間進行定位、純度分析,對不同切割試劑的切割效果的HPLC圖譜進行比較,對純化前和純化后的多肽HPLC圖譜進行比較;用ESI-MS分析確證分子量。
　　結果:
　　1 GHRP為肽

8、酰胺的結構,選擇Rink Amide-AM樹脂為載體;縮合體系選擇DIC/HOBt,價格低廉,且兩者配合使用能有效的降低消旋率,可以將副反應控制在很低的范圍內;反應投料摩爾比在1:4時能夠反應充分;反應時間一般150min,在連接Phe,His等這些易發(fā)生消旋副反應的氨基酸時,避免高溫反應環(huán)境,縮短反應時間在120min左右;替代度在0.45mmol/g時合成效果較好。
　　2 GHRP-6的3種切割試劑脫除保護基效果相似,所得產

9、物純度也較相近,其中切割溶液TFA:間甲酚(V/V99:1)的配比是最簡便的,成本也最小。GHRP-1、GHRP-2所用兩種切割試劑也能起到很好的效果。切割實驗進行時,反應液先在冰浴中反應0.5h,再30℃反應1h的裂解條件得到的產物副產物少,得率較高。
　　3合成的六肽的GHRP-6、GHRP-2和七肽的GHRP-1經 RP-HPLC檢測、ESI-MS確定分子量,合成正確;GHRP-6和 GHRP-2經半制備RP-HPLC分離純

10、化后純度大于95％,GHRP-1的純度大于85%。
　　結論:
　　本課題采用 Fmoc固相多肽合成方法合成了六個氨基酸組成的短肽GHRP-6、GHRP-2和七個氨基酸組成的短肽GHRP-1,三條肽中均含有D型非天然氨基酸;在合成中通過選擇消旋率小的縮合試劑,控制反應時間來減少副反應;比較了幾種不同的切割試劑對肽樹脂的切割效果,優(yōu)化了切割條件;半制備RP-HPLC分離、純化得到目標產品純度能夠達到95%以上;所得產物經RP-