己烯雌酚殘留免疫學(xué)快速檢測(cè)研究.pdf

1、己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)屬于非甾體雌激素，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高動(dòng)物瘦肉率等作用，曾經(jīng)被當(dāng)作促生長(zhǎng)劑普遍應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，因其對(duì)人類有很強(qiáng)的致畸、致癌等毒副作用，大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)已明確規(guī)定禁止在畜牧養(yǎng)殖中使用DES。為了降低動(dòng)物生產(chǎn)成本，不規(guī)范使用己烯雌酚的現(xiàn)象仍然存在。傳統(tǒng)的理化檢測(cè)技術(shù)雖然能夠監(jiān)測(cè)動(dòng)物源性食品中的DES殘留，但其存在用時(shí)長(zhǎng)、程序繁瑣、費(fèi)用高等不足，因此急需建立一種迅速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確

2、、成本低的分析方法。本研究應(yīng)用已制備的免疫原DES-BSA和己烯雌酚單克隆抗體(DES McAb)制備了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ci-ELISA)試劑盒(DES-Kit)和免疫膠體金標(biāo)記快速檢測(cè)試紙條(DES-Strip)，并用液相色譜法(HPLC)和氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)對(duì)DES-Kit和DES-Strip的性能進(jìn)行驗(yàn)證。
　　1.在分析DES分子結(jié)構(gòu)和免疫原性的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)在DES苯環(huán)的羥基(-OH)位點(diǎn)上引入活

3、性基團(tuán)羧基(-COOH)，合成具有半抗原結(jié)構(gòu)特征的己烯雌酚-單-羧基丙基-醚(DES-MCPE)，利用活性酯法使DES-MCPE與牛血清白蛋白(BSA)發(fā)生偶聯(lián)，合成免疫原DES-BSA，DES-MCPE與雞卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備包被抗原DES-OVA。利用紫外掃描(UV)和SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行初步鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DES-BSA紫外掃描圖的最大吸收峰發(fā)生偏移，DES-BSA的泳動(dòng)率小于BSA，判定

4、DES-BSA偶聯(lián)成功，并測(cè)得DES與BSA分子結(jié)合比為12.8∶1。用免疫原DES-BSA免疫3只BALB/c小鼠，5次免疫后獲得了抗DES多克隆抗體(DESpAb)，用間接ELISA檢測(cè)DES pAb的效價(jià)均大于1∶1.0×104，用ci-ELISA檢測(cè)DESpAb的半數(shù)抑制濃度(IC50)，其中測(cè)定結(jié)果最好的2號(hào)小鼠的IC50為18.221μg/L，與己烷雌酚(HEX)和雙烯雌酚的(DIEN)交叉反應(yīng)率(CR％)分別為8.09％、

5、3.63％，與其他競(jìng)爭(zhēng)物沒有交叉反應(yīng)(CR)。獲得了靈敏、特異、高效價(jià)的多克隆抗體。
　　2.利用ELISA篩選細(xì)胞融合鼠，應(yīng)用融合劑聚乙二醇(PEG4000)使SP2/0瘤細(xì)胞與免疫小鼠的脾細(xì)胞發(fā)生融合，生成的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)一步篩選、克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)己烯雌酚單克隆抗體(DES McAb)，選取4株敏感性和選擇性均好的抗DES雜家瘤細(xì)胞:1 B8 DES McAb、2 C4DES McAb、4 A1 DES

6、McAb、4 C7 DESMcAb，其細(xì)胞上清效價(jià)分別為:1∶2.56×102、1∶4.0×102、1∶1.2×102、1∶8.0×102，腹水效價(jià)分別為:1∶2.0×105、1∶2.56×105、1∶1.28×105、1∶5.12×105，親和常數(shù)(Ka)分別為:3.38×109、9.27×109、2.30×109、1.87×1010 L/moL，單抗亞型分別為:IgG2a/κ、IgG1/κ、IgG2a/κ、IgG2a/κ。ci-EL

7、ISA測(cè)定親和力最高的4C7株的IC50為0.49tg/L，與HEX和DIEN的CR％分別為7.66％、3.83％，與其他競(jìng)爭(zhēng)物沒有CR。
　　3.以DES McAb為基礎(chǔ)，優(yōu)化了ci-ELISA最佳實(shí)驗(yàn)條件。DES-OVA的包被濃度為0.5μg/mL， DES McAb的工作濃度為1∶6.4×104;酶標(biāo)二抗(GaMIgG-HRP)的稀釋濃度為1∶1×103;最佳包被條件為37℃，包被原DES-OVA孵育120min，37℃，5

8、％的豬血清封閉60min;室溫條件下，顯色時(shí)間為TMB顯色液作用10min。繪制出的ci-ELISA DES-Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示為典型的S型，與4參數(shù)logit曲線擬合相符，IC50為0.49ng/mL，檢測(cè)限為0.5 ng/mL;陰性的鯽魚肉、豬肉平均回收率分別為79.3％和81.63％，平均變異系數(shù)(CV)分別為9.28％、8.70％，平均批內(nèi)CV分別為9.7％、9.3％，平均批間CV分別為7.6％、7.0％，平均批內(nèi)CV和平均批

9、間CV均小于10％;與HEX和DIEN的CR％分別為6.53％、3.42％，與其他競(jìng)爭(zhēng)物沒有CR;在4℃、避光條件下，DES-Kit可存放6個(gè)月。
　　4.建立了膠體金的制備條件:以檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)作為還原劑，1.0％的氯金酸與1.0％的Na3C6H5O7·2H2O最佳的作用劑量比為1mL∶1.7 mL，金顆粒直徑為25 nm;膠體金標(biāo)記DES McAb的最佳標(biāo)記濃度為7.2μg/ml。應(yīng)用膠體金免疫層析

10、試驗(yàn)(GICA)原理和獲得的DES McAb制備DES-Strip，DES-Strip的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示為典型的S型，機(jī)讀檢測(cè)限為0.25μg/L，目測(cè)檢測(cè)限為2.0μg/L，10 min內(nèi)即可完成測(cè)定，與其類似物沒有CR，在4℃干燥條件下DES-Strip的保存期為9個(gè)月。
　　5.HPLC的確證檢測(cè)顯示，DES-Kit與HPLC的差異為2.7％～4.3％，DES-Strip與HPLC的差異為1.5％～4.9％;GC-MS的確證檢測(cè)