重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑在甲醇酵母中的高效表達.pdf

1、　 本研究根據(jù)人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑(HuPSTI)的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子人工設計合成了HuPSTI的全基因序列，克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K中，構建了分泌型表達載體pPIC9K-PSTI，用SacI線性化載體，采用電激法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，得到的His菌株再用G418篩選抗性克隆，然后進行搖瓶表達，探討了在不同pH條件下進行誘導以及不同甲醇濃度對HuPSTI表達量的影響?！　¤b于適合高密度發(fā)酵表達的特

2、點，本研究還對重組表達菌株KM71(pPIC9K-PSTI)進行發(fā)酵工藝摸索，研究了發(fā)酵pH值，誘導碳源和誘導時間對HuPSTI的表達量的影響。結果表明，當培養(yǎng)基pH為6.0時，誘導碳源為甲醇+甘油時，可獲得高表達量的HuPSTI蛋白。發(fā)酵上清經(jīng)采用陰離子交換層析(QSepharoseXL)和分子篩層析(SepherdexG50)可純化出HuPSTI目的蛋白，100ml發(fā)酵上清可獲得90mg電泳純的HuPSTI，比目前所知的重組HuPS

3、TI的最高表達量提高了18倍。蛋白N端測序結果表明本研究獲得的重組HuPSTI具有兩種結果：一種是與原蛋白序列一樣(rHuPSTI)，另一種是在N端多出兩個氨基酸EA(rHuPSTI，)。雖然兩種蛋白有兩個氨基酸的差別但它們的活性幾乎完全相同。本研究還對重組HuPSTI的性質(zhì)進行了分析，酶活測定表明純化的1mgHuPSTI可以抑制3.4-3.8mg牛胰蛋白酶(Trypsinfrombovinepancreas，6630U/mg，Sigm