生物催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯.pdf

1、近年來(lái)，隨著對(duì)不同光學(xué)異構(gòu)體藥理作用研究的進(jìn)展及對(duì)消旋藥物申報(bào)和使用的限制，手性藥物的研究和開發(fā)已經(jīng)成為國(guó)際新藥研究的熱點(diǎn)。利用生物催化技術(shù)來(lái)合成手性藥物及其中間體，其反應(yīng)條件溫和，光學(xué)純度高，副反應(yīng)少，收率相對(duì)較高，環(huán)境污染較少，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注。本文對(duì)整細(xì)胞生物催化不對(duì)稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE)進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容如下:
　　 ⑴建立了2-氧代

2、-4-苯基丁酸乙酯和2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的氣相色譜分析方法。在水相體系中對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的63株微生物菌株進(jìn)行了篩選，得到了一株能高效催化此還原反應(yīng)的克魯斯假絲酵母Candida krusei SW2026，該菌對(duì)產(chǎn)物立體選擇性高，效果穩(wěn)定，并表現(xiàn)出對(duì)底物具有一定的耐受能力。
　　 ⑵確定了克魯斯假絲酵母Candida krusei SW2026的羰基還原酶酶活定義及測(cè)定方法，并在搖瓶中對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最適

3、發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:4.5%葡萄糖，3%蛋白胨，1.5%牛肉膏，0.05%oMn2+；適宜的產(chǎn)酶發(fā)酵條件為初始pH6.0，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵周期48 h。
　　 ⑶研究了克魯斯假絲酵母Candida krusei SW2026催化不對(duì)稱還原OPBE生成(R)-HPBE的反應(yīng)條件，確定了該反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)體系最適pH為6，6?？疾炝溯o底物的影響，確定了最適輔底物為葡萄糖。最適菌體濃度為1

4、.5g/10 mL。同時(shí)研究了底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響，證明了底物對(duì)細(xì)胞的抑制作用。各添加劑對(duì)反應(yīng)沒有明顯促進(jìn)作用。通過流加底物的方式可以部分減弱底物的抑制作用并提高轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率。在優(yōu)化條件下反應(yīng)14 h，ee值和產(chǎn)率分別為97.55%和81.24%。初步嘗試了產(chǎn)物提取，將粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析進(jìn)行分離提純，最后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行核磁共振鑒定為(R)-HPBE。
　　 ⑷考察了非水相體系中克魯斯假絲酵母Candida krusei SW20

5、26催化還原反應(yīng)的情況。在水/有機(jī)溶劑兩相體系中，篩選得到非水相反應(yīng)介質(zhì)為鄰苯二甲酸二丁酯，并確定了其與水相的相體積比為1:1左右，pH6，6，溫度30℃，菌體濃度1.25g/10 mL時(shí)有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。在20 g/L底物濃度下，利用水/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系作為催化介質(zhì)，ee值，產(chǎn)率以及產(chǎn)物濃度分別可達(dá)到97.4%，82.0%和16.6 g/L。而該兩相體系存在產(chǎn)物提取問題。在水/離子液體兩相體系中，以[Bmim]PF6作為離