羥基磷灰石納米粒子抑制肝癌細胞增殖及其機理研究.pdf

1、納米粒子由于其獨特的納米生物學效應，已成為目前腫瘤防治研究工作的熱點。羥基磷灰石納米粒子具有抗癌活性，又具有良好的生物相容性，因而在抗肝癌研究中，受到越來越多的關注。 本文選用均勻沉淀法成功制備出粒徑范圍主要為44.6nm～86.8nm(HAP<,1>)、 301.6nm～1339.3nm(HAP<,2>)、843.2nm-2443.0nm(HAP<,3>)三種羥基磷灰石粒子。用 0.14 mmol/L、0.28 mmol/L、

2、0.56 mmol/L的HAP<,1>納米粒子以及0.56 mmol/L濃度的HAP<,2>和HAP<,3>粒子與肝癌細胞作用，通過光鏡觀察和MTT法、生長曲線及集落形成率定量測定，結果顯示HAP<,1>納米粒子對肝癌細胞的增殖能力有劑量和時間依賴性抑制作用，以0.56 mmol/L濃度處理肝癌細胞4d可達到顯著的抑制作用；而0.56 mmol/L濃度的HAP<,2>和HAP<,3>粒子對肝癌細胞的作用都很弱。由此推斷HAP<,1>納米

3、粒子的抑制肝癌細胞增殖作用與粒徑、濃度及作用時間有關，這為其體內外抗癌研究提供了依據。 通過三種不同粒徑的HAP粒子與肝癌細胞相互作用，經形態(tài)學觀察與分析可知HAP<,1>納米粒子很容易與肝癌細胞膜結合，肝癌細胞以非網格蛋白介導的細胞膜穴樣內陷途徑胞吞HAP<,1>納米粒子進入肝癌細胞，而HAP<,2>和HAP<,3>粒子不易與肝癌細胞膜結合，因而很少進入肝癌細胞。通過Fluo-3熒光探針標記細胞內游離Ca<'2+>，經熒光顯微

4、鏡觀察，HAP<,1>納米粒子使肝癌細胞的熒光增強，這說明HAP<,1>納米粒子進入肝癌細胞后，胞漿成份促進其降解。 通過Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫細胞化學PCNA染色，光鏡觀察以及圖像分析軟件的定量測定，HAP<,1>納米粒子使肝癌細胞的平均細胞核DNA含量下降、核仁內AgNOR數量減少以及PCNA表達減弱，從分子生物學角度證實了HAP<,1>納米粒子體外抑制肝癌細胞的作用，同時也揭示了HAP<,1>納米粒子的

5、抑癌機理①通過抑制DNA合成，主要是通過抑制DNA合成過程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干擾DNA的合成；②通過抑制rDNA的轉錄活性，抑制rRNA的合成，進一步抑制細胞內蛋白質的合成；⑧通過抑制PCNA的活性，影響細胞增殖周期的順利進行，延長細胞增殖時間。流式細胞術檢測結果也證實肝癌細胞被阻滯于增殖周期的G1期。 通過形態(tài)學觀察以及定量測試方法，可知HAP<,1>納米粒子體外抗肝癌作用緩慢，并不能快速殺死肝癌細胞，而首先

6、是作為一種抑制肝癌細胞增殖作用的藥物，通過逐漸影響其功能，最終導致細胞死亡。推測HAPl納米粒子是通過其降解產物以及粒子本身共同影響細胞的功能，表現出肝癌細胞由局部到整體的超微結構變化，最終誘導肝癌細胞以非程序性死亡的方式死亡一脹亡。成功建立了符合肝癌形態(tài)學特征的人肝癌裸鼠移植瘤模型，采用瘤內局部注射途徑，HAP<,1>納米粒子能明顯抑制肝癌移植瘤生長，治療1周和2周的抑瘤率分別為77.21％和51.32％。能明顯延長荷瘤鼠的生存時間。

7、對肝癌移植瘤組織做石蠟切片，Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫組織化學PCNA染色，通過光鏡觀察和圖像分析軟件定量測定，HAP<,1>納米粒子使移植瘤組織肝癌細胞的平均核DNA含量下降、核仁內AgNOR數量減少以及PCNA表達減弱，從分子生物學角度證實HAP<,1>納米粒子能明顯抑制移植瘤的肝癌細胞增殖，同時也揭示了抑制機理。 通過電鏡觀察發(fā)現移植瘤組織的肝癌細胞內有HAP<,1>納米粒子，推測其與進入體外培養(yǎng)肝癌細胞的

8、方式相同，并在胞質內降解，可能同樣是以降解產物及粒子本身影響細胞的功能，最終導致移植瘤組織的肝癌細胞死亡。由于體內是實體瘤組織，HAP<,1>納米粒子在肝癌組織的濃度高低分布不同，誘導肝癌細胞以程序性以及非程序性兩種方式死亡一凋亡及胞體割裂。 總之，HAP<,1>納米粒子體內抗肝癌的機理是：首先，①抑制肝癌細胞增殖，通過抑制DNA合成，主要是抑制DNA合成過程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干擾DNA的合成。通過抑制rDNA