Netrin-1調控缺氧誘導肝癌細胞上皮間質轉化的實驗研究.pdf

1、目的：肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，容易早期發(fā)生侵襲轉移，這也是其術后復發(fā)、療效差的主要原因。腫瘤微環(huán)境（包括氧濃度、細胞外基質、免疫細胞、間質細胞等）是影響腫瘤轉移的重要因素，其中缺氧是許多惡性腫瘤（如肝癌、前列腺癌，胰腺癌等）微環(huán)境的一個顯著特點，缺氧越嚴重提示腫瘤的預后越差。癌細胞主要通過上皮間質轉化獲得侵襲能力，進而突破基底膜發(fā)生轉移。本課題在研究缺氧對肝癌細胞EMT的誘導作用的基礎上，進一步研究缺氧環(huán)境中Netrin-1促進肝癌

2、細胞EMT的作用，并對其下游作用機制進行了深入探討。
　　 方法：通過1%O2低氧培養(yǎng)建立人肝癌細胞物理缺氧模型，缺氧條件下無血清培養(yǎng)72小時，倒置顯微鏡觀測肝癌細胞在缺氧條件下的形態(tài)改變，應用Western blot方法檢測上皮細胞標志蛋白E-cadherin、間質細胞標志蛋白Vimentin的表達變化，羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽檢測細胞內骨架重組，用Transwell檢測缺氧肝癌細胞遷移、侵襲能力。ELISA檢測缺氧肝癌細胞分泌的

3、Netrin-1，免疫熒光檢測Netrin-1在缺氧肝細胞中的表達。構建針對Netrin-1 mRNA的干擾質粒pshRNA-Netrin-1及陰性對照質粒pGensil-2，測序鑒定重組體。干擾質粒轉染肝癌細胞細胞，G418篩選穩(wěn)定轉染細胞株，RT-PCR和Western blot檢測Netrin-1表達的變化。缺氧條件下檢測轉染肝癌細胞形態(tài)改變、標志蛋白蛋白改變和功能改變。構建Netrin-1真核表達質粒，酶切鑒定，G418篩選穩(wěn)定

4、轉染細胞株。觀測過表達Netrin-1對肝癌細胞形態(tài)和遷移、侵襲能力的影響。同時給予Netrin-1蛋白作用肝癌細胞觀測其對肝癌細胞形態(tài)和遷移、侵襲能力的影響。免疫熒光觀測p-Akt在缺氧肝癌細胞中的表達，Western blot檢測缺氧條件下PI3K/Akt通路信號分子的表達，觀測PI3K抑制劑LY294002對缺氧誘導肝癌細胞EMT的影響。
　　 結果：在缺氧條件下，肝癌細胞由連接緊密的上皮樣變成連接松散的紡錘體樣，胞體狹長

5、，細胞分散，失去細胞間連接。Western blot結果顯示，缺氧條件下E-cadherin表達下降甚至消失，Vimentin表達顯著增加。鬼筆環(huán)肽檢測顯示，常氧條件下細胞包內F-actin主要位于細胞周邊，可見纖細的中間絲，缺氧培養(yǎng)后可見F-actin骨架重組，細胞周邊的F-actin重新排列成較粗的中間絲（緊張絲），緊張絲在細胞內平行排列拉伸細胞形態(tài)。細胞遷移實驗結果顯示，缺氧顯著促進HepG2細胞遷移能力（P<0.01），侵襲實驗

6、結果與遷移實驗結果一致。肝癌細胞穩(wěn)定轉染pshRNA-Netrin-1后，Netrin-1表達顯著下降，抑制率達72.79%%±5.11%。轉染pshRNA-Netrin-1肝癌細胞顯著抑制缺氧誘導肝癌細胞形態(tài)改變，同時抑制Vimentin表達，增加E-cadherin表達，對缺氧促進肝癌細胞遷移能力有顯著抑制作用，透膜細胞數（314±21）個較對照組（386±23）個顯著降低（P<0.05），侵襲實驗結果與遷移實驗結果一致。常氧條件下

7、，轉染Netrin-1真核表達質粒和用500ng/ml Netrin-1作用肝癌細胞，都觀測到細胞形態(tài)，呈紡錘體樣，細胞遷移、侵襲能力顯著增加。PI3K/Akt信號通路在缺氧條件下激活，p-Akt、NF-κB、Twist表達顯著增加，在LY 294002的作用下，缺氧誘導的細胞形態(tài)改變和E-cadherin減少均受顯著抑制，LY 294002抑制PI3K信號能阻斷缺氧誘導的肝癌細胞EMT。
　　 結論：缺氧環(huán)境中，Netrin-