整合素αυβ6在結(jié)腸癌細胞生存和侵襲中的作用及相關(guān)分子機制研究.pdf

1、研究背景： 整合素屬于粘附分子家族，是一類陽離子依賴的跨膜糖蛋白受體，由α、β亞單位以非共價鍵結(jié)合組成。整合素介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)，以及細胞與細胞之間的相互作用，通過細胞外基質(zhì)信號傳導(dǎo)促進細胞的粘附、增殖、轉(zhuǎn)移和分化。 整合素α vβ6是由α、β亞單位以非共價鍵結(jié)合組成的跨膜異二聚體，是一類只表達于惡性上皮性腫瘤組織而在正常組織及良性組織無表達的特殊整合素亞型，目前研究發(fā)現(xiàn)α vβ6在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)

2、揮重要作用，對其研究已成為熱點，并可為惡性腫瘤的診治提供廣闊的應(yīng)用前景。 在胚胎發(fā)育過程中以及上皮源性腫瘤及多種腫瘤細胞系，可見整合素α vβ6高表達。在成年組織炎癥和損傷修復(fù)過程中，α vβ6可促進上皮細胞增殖、遷移至損傷部位，幫助上皮的重建。在腺上皮來源消化道腫瘤中的表達強度以胰腺癌最高，其次為胃癌、結(jié)直腸癌、膽管癌、肝癌：鱗狀上皮來源腫瘤如肺癌、口腔鱗狀上皮癌亦可見其表達。 我們課題組對α vβ6與結(jié)腸癌之間的關(guān)系

3、進行了系統(tǒng)深入的研究：發(fā)現(xiàn)不同類型結(jié)腸癌細胞表面具有不同數(shù)量的α vβ6表達，且與腫瘤惡性程度密切相關(guān)；利用α vβ6-cDNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞系SW480，在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力顯著提高，動物實驗中成瘤率、瘤體質(zhì)量、體積等較未轉(zhuǎn)染組均有顯著增加，并且通過β6胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不同部位刪除后轉(zhuǎn)染技術(shù)證實β6獨有的C末端11個氨基酸是控制其惡性行為的關(guān)鍵部位；我們對α vβ6與信號通路之間的關(guān)系進行深入研究，通過免疫共沉淀

4、、免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)α vβ6與ERK之間存在直接連接；腫瘤細胞通過α vβ6-MAPK/ERK信號通路調(diào)控MMP-9分泌，隨著整合素α vβ6的表達增多MAPK活性增加并伴隨MMP-9分泌增多，加速破壞降解細胞外基質(zhì)促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)刪除β6胞內(nèi)段ERK結(jié)合位點（746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，下劃線表示兩者結(jié)合位點）可以顯著抑制腫瘤細胞的生長；我們的研究亦發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細胞中α vβ6可促進細

5、胞增殖，隨著腫瘤細胞密度增加伴有PKC活性增強，細胞可通過PKC途徑調(diào)控新生更多的α vβ6，α vβ6可通過PKC途徑誘導(dǎo)MMP-9的分泌增多，降解胞外基質(zhì)加速細胞擴增，如此交叉循環(huán)促進腫瘤的生長；我們利用反義寡核苷酸技術(shù)沉默α vβ6在結(jié)腸癌細胞系HT29和Widr的表達，顯著抑制MAPK活性，以及伴有細胞增殖侵襲能力的降低，在動物實驗中可達到抑制腫瘤生長的目的。 在最近組織學(xué)的研究中，Richard C.Bates等發(fā)現(xiàn)，

6、在結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）模型中可誘導(dǎo)α vβ6表達，組織芯片-免疫組織化學(xué)證實488例結(jié)腸癌組織中陽性表達率為37％，在淋巴結(jié)及肝癌轉(zhuǎn)移標本中均檢測到α vβ6的表達，α vβ6與中位生存時間密切相關(guān)，可作為結(jié)腸癌預(yù)后指標。我們利用組織芯片-免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測300例胃癌組織標本α vβ6的表達并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其陽性表達率為36.7％，并且與腫瘤病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，Ka

7、plan-Meier曲線分析α vβ6陽性表達患者生存期限明顯縮短，可作為胃癌的獨立預(yù)后指標。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)檢測358例原發(fā)結(jié)腸癌組織α vβ6陽性表達率（34.0％）明顯低于63例結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組織的表達率（71.4％），提示α vβ6陽性表達患者較陰性表達著更具有肝臟轉(zhuǎn)移能力，該研究為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移提供了新的理論支持，提示α vβ6在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用。 綜上所述，α vβ6作為一種重要的細胞粘附分子受體，在胃

8、腸道惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其具體的作用機制目前已成為研究熱點。本研究是在既往國內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，進一步探討α vβ6在結(jié)腸癌細胞生長侵襲中的作用及相關(guān)的分子機制，隨著研究的不斷深入，必將為特異性靶向抗腫瘤藥物的研制開發(fā)和惡性腫瘤的生物治療提供廣闊的應(yīng)用前景。 第一部分：整合素α vβ6通過MAPK信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移和胞外基質(zhì)降解 研究目的： 探討整合素α vβ6在結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的

9、作用及調(diào)控胞外基質(zhì)（ECM）降解的相關(guān)分子機制。 研究方法： 1.利用pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector質(zhì)粒構(gòu)建α vβ6特異性shRNA表達載體和對照組表達載體。α vβ6特異性shRNA表達載體以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞系HT2972小時，用RT-PCR，yestern blotting實驗分別檢測α vβ6 mRNA和蛋白的表達水平； 2.細胞侵襲實驗檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基

10、因沉默對結(jié)腸癌細胞HT29體外侵襲能力的影響； 3.Western blot實驗檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細胞ERK1/2，phospho-ERK1/2（P-ERK）表達的影響； 4.Western blot實驗檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細胞uPA表達的影響； 5.明膠酶譜法檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細胞MMP-2，MMP-9表達的影響； 6.[3H]標記的

11、Ⅳ型膠原降解分析實驗檢測RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默對結(jié)腸癌細胞胞外基質(zhì)降解能力的影響以及MAPK信號通路與uPA、MMP-2、MMP-9在胞外基質(zhì)降解中的作用。 結(jié)果： 1.特異性shRNA表達載體可有效抑制HT29細胞中α vβ6的mRNA和蛋白表達； 2.RNA干擾介導(dǎo)抑制α vβ6表達顯著抑制HT29細胞的體外侵襲能力； 3.RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默顯著抑制結(jié)腸癌細胞ERK1/2的表達，更

12、重要的是抑制了其活性形式即磷酸化ERK1/2（phospho-ERK1/2，P-ERK）的表達； 4.RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默顯著抑制結(jié)腸癌細胞uPA，pro-MMP-9和pro-MMP-2的分泌； 5.RNAi介導(dǎo)α vβ6基因沉默可顯著抑制胞外基質(zhì)的降解，且α vβ6介導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解是通過MAPK信號通路調(diào)控uPA、MMP-2、MMP-9分泌實現(xiàn)的。 結(jié)論： 整合素α vβ6特異性shRNA表

13、達載體，可有效抑制結(jié)腸癌細胞α vβ6的表達；沉默α vβ6表達可顯著抑制uPA、MMP-9、MMP-2以及ERK1/2介導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解；α vβ6通過MAPK信號通路調(diào)控uPA、MMP-9和MMP-2的分泌及活性，從而調(diào)控細胞外基質(zhì)的降解，在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用（見示意圖）。 意義： 本實驗研究結(jié)果進一步揭示出α vβ6在結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機制；進一步從細胞及分子水平上解釋了前期組織學(xué)研究