Cr（Ⅵ）在細胞p53封閉條件下的線粒體損傷效應.pdf

1、目的：在體外試驗系統(tǒng)，研究Cr(Ⅵ)在p53封閉條件下對L-02肝細胞線粒體的損害效應，為進一步探討Cr(Ⅵ)誘導細胞凋亡的獨立線粒體依賴性途徑奠定實驗基礎。 方法：以L-02肝細胞為受試細胞，通過MTT試驗分別檢測p53抑制劑(PFT-α)單獨及其與Cr(Ⅵ)共處理對L-02肝細胞存活率的影響，并檢測細胞核內(nèi)p53蛋白表達驗證PFT-α對p53的抑制作用，篩選出有效的PFT-α及Cr(Ⅵ)作用濃度。其后續(xù)試驗PFT-α濃度定為

2、20μmol/L，預處理4h，Cr(Ⅵ)濃度為20μmol/L，染毒時間為24h。將L-02肝細胞隨機分成對照細胞組(第1組)、Cr(Ⅵ)染毒組(第2組)、PFT-α預處理對照細胞組(第3組)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組(第4組)、PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組(第5組)、PFT-α+NAC+Cr(Ⅵ)染毒組(第6組)?；瘜W比色法檢測細胞氧化損傷；熒光分光光度法檢測線粒體通透性轉運孔(PTP)、跨膜電位(Δψm)的變

3、化；western blotting檢測細胞色素C(Cyt C)和凋亡誘導因子(AIF)的蛋白含量；RT-PCR檢測Bcl-2及Bax的基因表達水平；DNA ladder檢測細胞凋亡。 結果： 1.20μmol/L PFT-α預處理細胞后可以明顯抑制細胞核內(nèi)p53蛋白表達水平。 2.染毒處理細胞氧化損傷：Cr(Ⅵ)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組與PFT-α十Z-VAD-fmk-Cr(Ⅵ)染毒組引起SOD、GST活

4、性明顯降低，GSH含量減少，MDA生成增多，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；加入NAC后有明顯保護作用。 3.細胞線粒體膜損傷：與對照組相比Cr(Ⅵ)染毒組、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組和PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組細胞線粒體膜電位(△ψm)降低，PTP開放度增加，差異有顯著性(P<0.05)。加入NAC后有相應的拮抗作用。 4.細胞凋亡相關調(diào)控因子釋放：與對照組相比Cr(Ⅵ)染毒組、PFT

5、-α+Cr(Ⅵ)染毒組與PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組細胞胞漿CytC和AIF蛋白增加，加入NAC后均出現(xiàn)明顯減少(P<0.05)。 5.Bcl-2及Bax基因表達水平改變：與對照組相比Cr(Ⅵ)染毒組、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組與PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組細胞Bcl-2和Bax基因表達減少，加入NAC后均出現(xiàn)相應基因表達的增多。 6.細胞核DNA損傷：Cr(Ⅵ)、PFT-α+C

6、r(Ⅵ)與PFT-α+Z-VAD-fmk＋Cr(Ⅵ)染毒組細胞均出現(xiàn)凋亡典型的DNA梯帶降解現(xiàn)象，加入NAC后未見明顯保護作用。 結論：p53封閉條件下，20μmol/L Cr(Ⅵ)能明顯引起L-02肝細胞氧化應激，導致線粒體膜損傷、cyt C與凋亡誘導因子(AIF)釋放與細胞DNA損傷；同時在抑制caspase條件下，受試細胞仍然表現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。結果提示，Cr(Ⅵ)可能繞過p53/caspase環(huán)節(jié)直接通過損傷細胞線粒體而誘導凋