超聲作用下脂肪酶催化豆油水解反應的研究.pdf

1、當前應用最為廣泛的高溫高壓油脂水解技術及傳統的中壓催化水解技術存在著副反應嚴重和污染環(huán)境等不可避免的缺陷，而超聲波和酶催化技術都具有投資低、條件溫和、耗能低、副反應少、環(huán)境友好等特點，本文結合兩者的優(yōu)勢潛質，對超聲波—脂肪酶協同催化油脂水解反應進行了研究。 選擇具有安全無毒，成本低，可提高底物及產物體積濃度，產物分離純化步驟少等優(yōu)點的無溶劑體系，對常規(guī)恒溫振蕩水浴方式下的C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解的反應進行了研究

2、。得到C.lipolytica的反應特性為：最佳反應溫度在45℃附近；該酶為堿性脂肪酶，從pH6.1—8.3范圍內酶活力呈波浪式變化；當C.lipolytica濃度超過1％(w/w)時，出現明顯的酶濃度抑制現象；水油比超過0.675：1(w/w)后，反應速率的變化趨于平衡。在此基礎上進行了響應面分析，建立了能夠反映各條件因素對反應進程影響程度的數學模型，對實驗數據進行的方差分析和典型分析結果顯示：溫度、加酶量對水解反應影響高度顯著，而緩

3、沖溶液pH、水油比在實驗范圍內對反應的影響不顯著。C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應的最優(yōu)反應條件為：溫度42.2℃、pH7.51、加酶量0.85％(w/w)、水油比1.24(w/w)。 超聲反應中，超聲功率的大小是酶催化反應非常重要的影響因素，在本文所研究的功率范圍內沒有發(fā)現酶失活現象。實驗結果顯示隨著超聲強度的增加水解反應速率增大，當超聲強度超過1.20W/c㎡時，反應速率隨功率的增加變化緩慢，但是通過精密度實驗

4、發(fā)現隨著超聲強度的增加實驗結果的穩(wěn)定性得到了提高，說明在較低超聲強度下，輸出功率的波動對反應速率的影響較大，綜合考慮后選擇了1.64W/c㎡的超聲波進行后續(xù)研究。 研究了超聲波對C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應的影響作用，通過與振蕩水浴方式下實驗結果的對比發(fā)現超聲波使C.lipolytica的耐熱性有了5℃左右的提高；可以避免或是減少酶在油水界面的聚集，沒有出現酶濃度抑制反應現象；在超聲反應中，水變得更加“有效”，

5、即水解反應按照假單底物規(guī)律進行時水的濃度臨界值較低；而pH的變化規(guī)律與振蕩水浴中一致，表明超聲作用沒有改變該酶的離子化反應狀態(tài)。對超聲作用下的C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應進行了響應面分析，建立了能夠反映各條件因素對反應進程影響程度的數學模型，并得到超聲作用下的最優(yōu)反應條件為：溫度47.0℃、pH7.77、加酶量0.77％(w/w)、水油比0.71(w/w)。 復合酶反應是通過兩種或多種酶的協同作用，使其催化能力

6、得到明顯提高的一種酶反應技術。本文對Sigma-3126，生工PPL，CLL，Novo435和Amano—G五種不同來源的脂肪酶進行了篩選和復配，得到了水解效果較好的CLL和Amano—G組合。對各種反應條件進行了研究，確定最優(yōu)工藝條件為：CLL和Amano—G的加入量分別為1％(w/w)和0.1％(w/w)；在CLL反應進行1h后加入Amano—G；反應溫度45℃；去離子水直接加入反應體系作為水相，水油比1:1(w/w)。在此條件下，

7、超聲波對反應有一定的促進作用，在反應開始階段其作用尤為明顯，24h的豆油水解率可以由常規(guī)振蕩水浴中的45.7％提高到94.2％。 酶催化反應動力學是了解酶作用機理的重要途徑之一，動力學模型能夠比較準確的反映某個酶反應系統中的各種相互作用對反應的影響程度。目前大多數脂肪酶油脂水解反應模型都是假設油水兩相的界面面積為常數，這樣的假設在無溶劑體系中是不恰當的。本文在建立了有效底物濃度模型的基礎上，將有效底物濃度和油水界面面積的變化相結

8、合，建立了一個新的動力學模型。 對所建立模型的適用范圍應用亞甲基藍染色—顯微鏡法進行了驗證，證明該模型在油相體積分數，從0.1—0.9范圍內適用；應用TLC掃描分析法證明有效底物濃度模型的假設條件在F=0.1—0.9范圍內可靠。并將所得動力學模型應用于C.lipolytica脂肪酶催化的豆油水解反應中，在求得反應初速度和Sauter直徑隨F變化規(guī)律的基礎上，應用非線性回歸擬合技術分別求出了振蕩水浴和超聲作用下模型參數的具體數值。

9、分別討論了動力學參數Ke、k*cal和kd/kp對反應速率的影響作用，并結合具體反應對參數的實際物理意義進行了解釋與分析。 應用所建立的有效底物濃度模型，對底物抑制現象給出了合理的解釋，指出實驗中出現的底物抑制現象只是“表觀”底物濃度抑制，反應速率實際是由有效底物濃度所控制，超聲波能夠減小底物抑制，加快反應進行，其根本原因是由于超聲波對有效底物濃度的影響而引起的。 熱力學研究可以避免體系結構和過程機理所造成的局限，有利于

10、對反應的宏觀特征進行分析。本文對熱力學公式進行了推導，測得了C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應在200rpm振蕩水浴和240V超聲功率條件下的反應活化能Ea分別為10.33kJ/mol和10.24kJ/mol；指前因子A分別為2.85和3.35。并以45℃下的反應為例，計算并討論了熱力學常數△≠H、△≠G和△≠S在振蕩水浴和超聲作用下的變化情況。 在綜合前人的研究成果和本論文的實驗基礎上，對超聲促進C.lipolyt