組織工程尿道的初步研究.pdf

1、尿道組織工程的初步研究組織工程是一門新興學科，它是利用生物學和工程學原理研究、開發(fā)用于修復、維持和改善損傷組織功能的組織替代物的一門學科。自從80年代正式確立以來，已經(jīng)取得了突破性的進展，目前處于研發(fā)階段的組織工程產(chǎn)品很多。組織工程產(chǎn)品不但解決了供者器官來源不足的問題，而且大幅減輕了發(fā)生異體移植物排斥反應的危險。 本試驗研究目的是研究尿道上皮與平滑肌及骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的方法，探討以膀胱脫細胞基質(zhì)(bladderacell

2、ularmatrixgraft，BAMG)為支架進行以上細胞體外培養(yǎng)的方法和可行性，為利用組織工程技術(shù)進行尿道重建提供實驗基礎(chǔ)。 實驗主要包括以下五個部分：第一部分探討了兔尿路移行上皮(UEC)細胞的體外培養(yǎng)，手術(shù)獲取兔尿道粘膜標本，以組織塊法，添加有50μg/ml牛垂體提取物，5ng/ml表皮生長因子DMEM/F12細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。結(jié)果添加BPE與rEGF較DMEM/F12體系適合UEC生長，組織塊接種后5～7天可見上皮細

3、胞生長，至12～14天可傳代。經(jīng)免疫細胞化學與透射電鏡檢查證實為兔UEC細胞。細胞生長曲線與細胞貼壁率曲線均顯示細胞的良好生長活性。細胞凍存三個月后復蘇細胞形態(tài)與生命力維持正常。本部分實驗推知DMEM/F12能促進UEC體外增殖，可獲得大量UEC種子細胞。 第二部分討論了兔尿路平滑肌細胞(USMC)的體外原代培養(yǎng)。在無菌條件下獲取兔尿道平滑肌標本。用復合酶消化法，消化液含有0.2％Ⅰ型膠原酶、2.5mg/mlDispase、3％

4、胎牛血清(FBS)；在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化。結(jié)果復合酶消化5～7h后可收集一定細胞并接種培養(yǎng)。大約7天可傳代。細胞經(jīng)凍存與復蘇后生長活力無顯著差異。經(jīng)α-actin免疫組織化學鑒定所得細胞為平滑肌細胞(SMC)。本實驗培養(yǎng)的兔USMC生長力旺盛，可傳代6～7次，所得細胞經(jīng)鑒定為SMC，可為尿路組織工程與其他細胞生物學實驗提供豐富的細胞來源。 第三部分嘗試構(gòu)建尿道細胞—脫細胞基質(zhì)支架支架復合體。我們以從從兔膀胱中提取制成脫細胞基質(zhì)作

5、為細胞支架，將實驗獲得的細胞單獨接種于BAMG的一側(cè)、兩種細胞分別接種于同一支架的兩側(cè)，每7天取出標本進行HE染色，觀察細胞在基質(zhì)上的生長情況。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種方法可制備出細胞—支架復合體。本研究一方面證實了我們培養(yǎng)出的尿路細胞進行組織工程后續(xù)實驗的能力，另一方面也證實該BAMG可作為細胞生長的底物，能促進細胞黏附與生長。 第四部分獲取幼兔骨髓組織，采用梯度離心法在體外用αDMEM培養(yǎng)液進行MSCs分離培養(yǎng)。結(jié)果原代骨髓間充質(zhì)干

6、細胞在經(jīng)過傳代換液后，基本得到純化，約10～12天時間擴增形成單層。可傳代培養(yǎng)8代。細胞凍存后復蘇細胞形態(tài)與生命力維持正常。流式細胞儀檢測結(jié)果表明細胞表面抗原CD44+，CD45-，與國際相關(guān)報道一致。本試驗證實了兔骨髓間充質(zhì)細胞生長力旺盛，可傳代多次，可用作尿道組織工程的種子細胞。 第五部分嘗試構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細胞—脫細胞基質(zhì)支架支架復合體。將培養(yǎng)出的骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，接種于脫細胞基質(zhì)一側(cè)。于3-6天取出后以掃描電