耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌整合子相關(guān)研究.pdf

1、背景與目的：過(guò)去幾十年中，隨著抗生素在臨床的廣泛使用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生。銅綠假單胞菌是引起院內(nèi)感染的一種重要細(xì)菌，但由于多重耐藥株尤其是耐碳青霉烯類(lèi)分離株的不斷出現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái)很大困難。研究發(fā)現(xiàn)，從外界獲得耐藥基因是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制之一。整合子是近年新發(fā)現(xiàn)的一種移動(dòng)性基因元件，它存在于細(xì)菌的基因組或質(zhì)粒上，通過(guò)位點(diǎn)特異性重組的方式捕獲外界基因（包括耐藥基因）并使其表達(dá)，且細(xì)菌的耐藥性可隨著整合子的轉(zhuǎn)移在細(xì)菌中傳播。此外，一個(gè)

2、整合子可攜帶多種耐藥基因，從而使宿主菌表現(xiàn)為多重耐藥。由于整合子在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和傳播方面的重要性，目前已引起了研究者們的重視。在本研究中，我們將關(guān)注耐碳青霉烯銅綠假單胞菌中整合子的分布、攜帶耐藥基因的情況以及啟動(dòng)子的類(lèi)型，并對(duì)整合子陽(yáng)性菌株的同源性進(jìn)行分析，以期闡明此種多重耐藥菌的來(lái)源。
　　方法：
　?。?）用WHONET5.6軟件，對(duì)2012年1月至2014年12月李惠利醫(yī)院臨床分離的1130株銅綠假單胞菌的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)

3、行回顧性分析，以了解我院銅綠假單胞菌的臨床分布及耐藥性情況。
　?。?）用 PCR技術(shù)對(duì)臨床分離的336株耐碳青霉烯類(lèi)藥物的銅綠假單胞菌進(jìn)行第1類(lèi)和第2類(lèi)整合子進(jìn)行篩查，以了解整合子在實(shí)驗(yàn)菌株中的分布情況。
　　（3）對(duì)整合子陽(yáng)性菌株的可變區(qū)、可變區(qū)啟動(dòng)子 PC和P2分別擴(kuò)增后測(cè)序，明確可變區(qū)基因和啟動(dòng)子的種類(lèi)及排列方式，并分析其與實(shí)驗(yàn)菌株的耐藥性之間的關(guān)系。
　?。?）采用腸桿菌科基因組間重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（ERI

4、C-PCR）的方法，對(duì)整合子陽(yáng)性菌株進(jìn)行同源性分析，以探討其來(lái)源。
　　結(jié)果：
　　（1）1130株銅綠假單胞菌主要分離自呼吸道標(biāo)本，以重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）、神經(jīng)外科和呼吸科居多，其對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗生素的耐藥率均在90％以上，對(duì)喹諾酮類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)的耐藥率也達(dá)到25.3%和30.7%，且呈逐年上升趨勢(shì)；耐碳青霉烯銅綠假單胞菌共336株，它們對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶等的耐藥率均顯著高于碳青霉烯類(lèi)敏感組。
　　（2）

5、336株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌中，第1類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株共有42株，陽(yáng)性率為12.5%，沒(méi)有篩選到第2類(lèi)整合子；2012年至2014年第1類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株檢出率數(shù)值分別為9.2%、12.6%、16.2%，呈逐年上升趨勢(shì)，攜帶整合子菌株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率均顯著高于整合子陰性菌株。
　?。?）在針對(duì)42株整合子陽(yáng)性菌株可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，33株有擴(kuò)增產(chǎn)物，9株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1.5kb或3kb，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析后顯

6、示為 aadA6△-orfd和aadA6△-ISPa21- aadA6△-orfd基因盒，其主要介導(dǎo)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥。經(jīng)分析，以上耐藥基因盒的存在與細(xì)菌的相應(yīng)耐藥表型具有高度相關(guān)性。
　?。?）對(duì)42株第1類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株的可變區(qū)啟動(dòng)子Pc的擴(kuò)增和分析結(jié)果顯示：38例（90.4%）為PcH1（雜合1型啟動(dòng)子），PcW（弱啟動(dòng)子）2例，PcS（強(qiáng)啟動(dòng)子）2例；未檢出有活性的P2啟動(dòng)子。
　　（5）對(duì)42株整合子陽(yáng)性菌株進(jìn)

7、行 ERIC-PCR基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 A、B、C、D、E共5型，其中A型38株（A1型32株，A2型6株），占90.4%；B、C、D、E型各有1株；A基因型主要來(lái)自ICU和神經(jīng)外科。
　　結(jié)論：本地區(qū)分離的銅綠假單胞菌多重耐藥率較高，其中，耐碳青霉烯菌株的整合子攜帶率雖相對(duì)較低，但呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)；其攜帶的整合子主要以第1類(lèi)為主，可變區(qū)整合的耐藥基因主要介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥，基因型與菌株的耐藥表型呈高度相關(guān)；可變區(qū)啟動(dòng)子