通過血腦屏障的短肽藥物載體平臺技術的建立和短肽結合蛋白的篩選.pdf

1、本論文通過設計和構建短肽-HSA融合蛋白表達載體,表達純化融合蛋白,體外細胞學及動物體內實驗,建立了一個驗證模擬多肽作為載體轉導蛋白質通過血腦屏障的技術平臺,為今后大規(guī)模的篩選驗證打下基礎.同時,我們還對短肽能夠在血管內皮細胞上定位的機制進行了初步研究,希望發(fā)現腦部血管內皮細胞上新的與血腦屏障有關的標志分子.首先,酵母分泌型表達載體的構建.設計和構建了帶有短肽基因插入位點的融合基因序列EcoRI-Kozak-α-factor-(EagI

2、)(XhoI)-HSA-EcoRI,將融合基因用EcoRI酶切后克隆至pAO815的EcoRI位點,得到pAO-HSA.人工合成兩個短肽基因,在兩端加上EagI和XhoI酶切位點,雙酶切后插入pAO-HSA質粒中,得到pAO-7/12-HSA.隨后,利用畢赤酵母表達體系完成了重組蛋白的表達、純化,并得出了重組蛋白穩(wěn)定表達以及大量純化的條件.三種重組蛋白的表達量都在10 mg/L左右,能夠穩(wěn)定表達,經過疏水柱層析和Sephadex G-1

3、00凝膠過濾層析兩步純化后均可得到純度高于85%的產物.然后,體外培養(yǎng)HUVEC細胞,通過免疫熒光結合流式細胞儀檢測短肽-HSA融合蛋白進入血管內皮細胞的能力.結果顯示三種重組蛋白均能夠進入細胞,而且進入的量相差不多.這說明該細胞能夠主動攝取rHSA,很可能細胞表面表達有HSA受體.今后的篩選中以采用腦部血管內皮細胞進行細胞學實驗較好.最后,動物體內實驗對短肽-HSA融合蛋白能否通過血腦屏障進行了驗證.將重組蛋白通過尾靜脈注射小鼠,4

4、hr后麻醉小鼠,取出腦組織進行免疫組化檢測.結果顯示,與未注射蛋白的陰性對照組相比,注射了rHSA,7-rHSA,和12-rHSA的小鼠腦組織未見到明顯差異,在小血管內皮細胞上沒有見到著色,腦實質也沒有明顯著色.今后的實驗中將在已建立的技術平臺上進行大規(guī)模的驗證,以期能夠篩選到理想的載體.同時,我們還利用酵母雙雜交篩選腦cDNA文庫,篩選能夠與環(huán)7肽結合的蛋白編碼順序,對環(huán)7肽能夠在腦血管內皮細胞上定位的機制進行了初步探討.結果顯示,電