人可溶性CD14檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、國(guó)內(nèi)關(guān)于sCD14的研究極少,究其原因,與目前尚無(wú)國(guó)產(chǎn)試劑盒而國(guó)外進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴有關(guān).為解決這一困難,推動(dòng)該領(lǐng)域的研究,并為國(guó)內(nèi)關(guān)于CD14的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供技術(shù)支持,該研究建立了人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測(cè)體系;同時(shí),還從人血漿中提取了天然sCD14,并進(jìn)行了人CD14基因的克隆和表達(dá),為在后續(xù)工作能深入研究CD14的生物學(xué)功能,探討CD14與Toll樣受體的相互作用以及在抗感染免疫中發(fā)揮的作用奠定了必要的基礎(chǔ).一

2、、建立人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測(cè)體系首先進(jìn)行了抗人CD14單克隆抗體的純化和多克隆抗體的制備.利用己獲得的抗人CD14單抗和多抗建立人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測(cè)體系.通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,確定了單抗60bca包被濃度,兔抗人CD14多抗和HRP-羊抗兔IgG的工作濃度;用IBL公司進(jìn)口人sCD14檢測(cè)試劑盒標(biāo)定混合正常人血清,作為該檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控血清.該研究利用自行建立的sCD14檢測(cè)體系,測(cè)定了154名正常人

3、,137名神經(jīng)內(nèi)科住院患者以及300余名心內(nèi)科住院患者血清標(biāo)本.經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):健康人群中不同年齡組血清sCD14水平有一定差異;腦梗塞患者血清sCD14水平顯著高于同年齡段正常對(duì)照組;急性冠脈綜合征(急性心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛)患者血清sCD14水平也有顯著升高.以上研究為進(jìn)一步探討sCD14在心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù).二、人可溶性CD14的提取與制備為獲得純化人CD14蛋白用于后續(xù)工作,我們利用免疫親和層

4、析技術(shù)從人血漿中提取天然sCD14蛋白.將純化的單抗60bca與CNBr-actived Sepharose 4B交聯(lián),制備了sCD14親和層析柱,從200ml人血漿中純化獲得400μg sCD14蛋白,經(jīng)Western Blot和商品ELISA試劑盒鑒定,其特異性較好,保持了天然蛋白的生物活性.我們的后續(xù)工作包括:(1)進(jìn)一步推廣sCD14檢測(cè)體系在基礎(chǔ)研究與臨床中的應(yīng)用;(2)繼續(xù)探索獲得大量表達(dá)重組人CD14蛋白的實(shí)驗(yàn)條件,并通過(guò)