NICD在不同分化胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)影響.pdf

1、目的:
　　 1.研究Notch1胞內(nèi)段NICD(Notch1 Intracellular Domain)在不同分化程度胃癌組織中的差異性表達(dá)。
　　 2.研究外源性NICD過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞株AGS的增殖、轉(zhuǎn)移以及化療敏感性的影響。
　　 方法:
　　 1.收集溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2012年胃癌手術(shù)標(biāo)本共12例。其中男性9例，女性3例，平均年齡66.25±11.86歲，其中高分化腺癌3例、中分化腺癌3例

2、，低分化腺癌3例及未分化腺癌3例。所有患者術(shù)前均未接受放療和化療。另取同期門診胃鏡室行活檢術(shù)取得的正常胃組織12例，其中男9例，女3例，平均年齡62.8±5.1歲。所有病例均獲得倫理審查委員會(huì)機(jī)構(gòu)的倫理批準(zhǔn)。所有標(biāo)本均保存于液氮中。采用Western Blotting法檢測(cè)不同胃組織季正常胃組織中NICD的相對(duì)表達(dá)量。
　　 2.用陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine2000將攜帶有NICD胞內(nèi)段的真核表達(dá)質(zhì)粒(pIERS2-

3、EGFP-NICD)轉(zhuǎn)入AGS細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的AGS細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，AGS細(xì)胞作為空白組。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，采用500μg/ml G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選，篩選二十天后半量(250μg/ml)維持培養(yǎng)。
　　 3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)三組細(xì)胞Notch1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。采用Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞NICD蛋白表達(dá)。
　　 4.采用CCK8法檢測(cè)三組細(xì)胞的細(xì)胞增殖，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

4、三組細(xì)胞的侵襲能力，順鉑(DDP)、氟尿嘧啶（5-FU）檢測(cè)外源性NICD過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)(P＜0.05)。
　　 結(jié)果:
　　 1.胃癌組織中，隨著分化程度的降低，NICD的表達(dá)逐漸升高（圖1A），正常胃粘膜組織NICD相對(duì)表達(dá)量為0.20±0.01;高分化胃癌組織NIC

5、D相對(duì)表達(dá)量為0.50±0.03;中分化胃癌組織NICD相對(duì)表達(dá)量為0.61±0.03;低分化胃癌組織NICD相對(duì)表達(dá)量為0.73±0.10;未分化胃癌組織NICD相對(duì)表達(dá)量為0.90±0.17(圖1B)。胃癌組較正常組表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05, t=9.439)。
　　 2.轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及陰性對(duì)照組細(xì)胞均帶有綠色熒光，空白對(duì)照組則無(wú)熒光。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，與陰性對(duì)照組細(xì)胞

6、、空白對(duì)照組細(xì)胞相比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞下游基因Hes1、NF-κ B2mRNA表達(dá)明顯增加，而JAG1、notch1基因則無(wú)明顯變化。Western blot證實(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞NICD蛋白表達(dá)量明顯增加。
　　 4.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞同對(duì)照組細(xì)胞相比，增殖率明顯升高;Transwell實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過(guò)transwell小室數(shù)58.8±7.4，陰性對(duì)照組細(xì)胞22.6±3.17，空白對(duì)照組細(xì)胞23±2.86。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移能力高于對(duì)照組(P