Lactobacillus brevis NCL912的耐酸特性及其酸脅迫下差異表達蛋白的研究.pdf

1、乳酸菌是一類非常重要的食品微生物,在食品中的應(yīng)用可以追溯到數(shù)千年以前。它具有提高食品營養(yǎng)價值,改善食品風(fēng)味,延長保存時間的功能,還具有多種有益于人類健康的活性。短乳桿菌是其中之一。近年來,短乳桿菌做為發(fā)酵劑、益生菌等被廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)生產(chǎn)中。但是由于自身產(chǎn)酸,在保存、食用過程中也會遇到外界酸性環(huán)境的影響,使得短乳桿菌不可避免的面臨酸脅迫。酸脅迫對短乳桿菌的存活、生長及生理活性有很大的影響。因此,為了生存、增殖并發(fā)揮其有益宿主健康的功能

2、,短乳桿菌必須具有應(yīng)對酸脅迫的能力,并對酸脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)來保護其生存、增殖。如果能夠找到提高乳酸菌耐酸能力的方法或途徑,將會極大地推動乳酸菌在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。從理論意義上,對酸脅迫下乳酸菌的蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究,不僅可以了解乳酸菌在酸應(yīng)激反應(yīng)中蛋白質(zhì)的表達變化,而且可以了解生物在逆境中的某些相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的功能,進而分析揭示其酸應(yīng)激反應(yīng)的機制。
　　 Lactobacillus brevis NCL912是本實驗分離得

3、到的一株乳酸菌,具有高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸鈉成為γ-氨基丁酸的能力。本論文主要研究了以下內(nèi)容。
　　 1.觀察了L.brevis NCL912在酸性環(huán)境下的生長及在pH2.0極端酸性環(huán)境中的耐酸性能。結(jié)果表明,L.brevis NCL912在pH3.5～6.4的酸性環(huán)境中可以生長,其最適生長pH是5.0。在pH2.0的極端酸性培養(yǎng)基中,該菌能夠存活4～6h。
　　 2.比較了添加與未添加L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevi

4、s NCL912的生長、存活、γ-氨基丁酸產(chǎn)量及谷氨酸脫羧酶活力,并對該菌的酸應(yīng)激反應(yīng)機制進行了分析。結(jié)果表明,添加L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912生長較好。在pH3.5～5.0條件下,L.brevis NCL912可以完全利用培養(yǎng)基中添加的L-谷氨酸鈉生成γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸的產(chǎn)量分別達10.77,11.44,10.94g／L。在兩種培養(yǎng)基中細菌的存活率和谷氨酸脫羧酶活力存在顯著性差異(p<0.05),添加

5、L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌耐酸性強,酶活力高。說明L-谷氨酸鈉對該菌在酸性環(huán)境中的生長、存活有重要的影響,其原因可能與γ-氨基丁酸的生成有關(guān),即谷氨酸脫羧酶-γ-氨基丁酸逆向運輸系統(tǒng)可能是該菌的酸應(yīng)激反應(yīng)機制。
　　 3.乳酸菌的酸應(yīng)激反應(yīng)是一個涉及到多個基因和蛋白質(zhì)的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系。它不僅與依賴外部氨基酸的酸應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān),而且菌體內(nèi)部其他蛋白質(zhì)也可能發(fā)生改變以應(yīng)對酸脅迫。目前對短乳桿菌酸應(yīng)激反應(yīng)中菌體蛋白的差異表達及功能

6、分析報道較少。因此,從蛋白質(zhì)組學(xué)水平,對L.brevis NCL912在酸脅迫下菌體蛋白質(zhì)的變化進行了研究。
　　 本研究得到了均勻、背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的L.brevis NCL912的雙向凝膠電泳圖譜。對pH5.0和pH4.0條件下培養(yǎng)的該菌總蛋白質(zhì)電泳圖譜進行比較,發(fā)現(xiàn)有25個差異表達蛋白,其中8個蛋白點得到了質(zhì)譜鑒定。其中7個蛋白點表達上調(diào),1個蛋白點表達下調(diào)。表達上調(diào)的7個蛋白點包括:酸應(yīng)激蛋白2個,分別是通用

7、應(yīng)激蛋白UspA蛋白和含CBS結(jié)構(gòu)域蛋白；與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的蛋白3個,分別是50S核糖體蛋白L10,核糖體循環(huán)因子和SSU核糖體蛋白S30P；與代謝相關(guān)的蛋白是依賴NADP的3-磷酸甘油醛脫氫酶；與核苷酸合成有關(guān)的蛋白是次黃嘌呤核苷酸脫氫酶。表達下調(diào)的蛋白是一個假設(shè)蛋白LVIS_0520,其功能未知。
　　 在酸脅迫條件下,L.brevis NCL912 CBS結(jié)構(gòu)域蛋白基因的mRNA表達水平呈顯著上升(p<0.05),與蛋白質(zhì)

8、圖譜上蛋白表達水平的變化一致,說明該菌蛋白質(zhì)和mRNA表達水平之間有較好的相關(guān)性。
　　 4.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對添加L-MSG培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912在酸脅迫條件下的差異蛋白表達也進行了探討。結(jié)果表明,在酸脅迫條件下,添加L-MSG培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912有26個蛋白發(fā)生了差異表達,其中11個蛋白得到了鑒定。這11個蛋白包括:通用應(yīng)激蛋白UspA蛋白、熱應(yīng)激蛋白GrpE、3-磷酸甘油醛脫氫

9、酶、核苷-二磷酸-糖差向異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶PlsX、磷脂結(jié)合蛋白、S-核糖同型半胱氨酸酶、延伸因子Tu、RNA結(jié)合蛋白以及假設(shè)蛋白BRAFLDAFT_64486。轉(zhuǎn)錄學(xué)水平的驗證表明該菌蛋白質(zhì)和mRNA表達水平之間有較好的相關(guān)性。
　　 5.對添加與未添加L-谷氨酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)的L.brevis NCL912已鑒定蛋白質(zhì)的功能進行了分析比較,發(fā)現(xiàn)在酸脅迫條件下,無論是否添加底物氨基酸,L.brevis NCL912都