新西蘭兔羊水間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及體外聯(lián)合誘導向心肌樣細胞分化的研究.pdf

1、背景與目的：羊水干細胞具有接近全能干細胞的分化潛能，增值速度快，無致瘤性，免疫原性低，且取材方便，方法簡單安全，不涉及倫理問題，已逐漸成為干細胞來源的研究熱點。作為新型的種子細胞，羊水干細胞已用于治療心血管疾病的研究中。多項研究結(jié)果表明，羊水干細胞可以分化為心肌樣細胞，但是轉(zhuǎn)化的比例和數(shù)量有限，如何提高向心肌細胞分化的效能是心血管干細胞治療迫切需要解決的問題之一。本實驗設(shè)計從新西蘭兔中提取培養(yǎng)出羊水間充質(zhì)干細胞(amniotic flu

2、id mesechymal stem cells，AF-MSCs)，通過5-氮胞苷(5-Azacytidine，5-Aza)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)單獨及聯(lián)合應(yīng)用，體外誘導AF-MSCs向心肌樣細胞分化。研究兔AF-MSCs的成功培養(yǎng)條件和體外分化為心肌樣細胞的能力，以及通過對誘導分化的細胞進行心肌細胞的特異蛋白檢測來比較5-Aza、TGF-β1的聯(lián)合誘導與各自單獨誘導的

3、效果。為干細胞向心肌樣細胞分化尋找更高效的誘導方法，為心血管疾病的干細胞治療奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法：(1)收集孕新西蘭兔羊水進行培養(yǎng)。取90％融合的P3兔AF-MSCs，用流式細胞儀檢測其表面抗體CD29、CD44和CD34，用Cell Quest軟件進行分析；采用Western Blot法和免疫熒光法檢測全能干細胞特異性蛋白OCT-4。
　　(2)AF-MSCs在體外定向誘導分為四組：5-Aza與TGF-β1聯(lián)合誘導組、

4、5-Aza單獨誘導組、TGF-β1單獨誘導組和空白對照組。取第3代生長狀態(tài)良好的AF-MSCs進行常規(guī)培養(yǎng)條件下藥物誘導。分別于誘導3、4周用Western Blot法檢測心肌細胞特異性蛋白cTnT、Connexin43來比較向心肌樣細胞分化的程度，用Image J分析軟件進行灰度分析，用SPSS16.0對結(jié)果進行統(tǒng)計。
　　結(jié)果：(1)兔羊水中可分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，其表面標記CD29、CD44陽性表達，CD34陰性表達；OC

5、T-4陽性。
　　(2)AF-MSCs分別經(jīng)5-Aza、TGF-β1及二者聯(lián)合體外誘導可向心肌樣細胞分化。5-Aza與TGF-β1聯(lián)合誘導組在誘導21天和28天時特異性蛋白cTnT和間隙連接蛋白Connexin43含量表達較5-Aza單獨誘導組及TGF-β1單獨誘導組均高(P<0.05)；經(jīng)5-Aza體外誘導的AF-MSCs在誘導21天后向心肌樣細胞分化不明顯，誘導28天時分化明顯；經(jīng)TGF-β1體外誘導的AF-MSCs在誘導21