谷氨酸脫氫酶在細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及其在谷氨酸檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、本研究針對(duì)谷氨酸檢測(cè)所存在的成本高昂、特異性低、穩(wěn)定性差等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了一種利用微生物表面展示技術(shù)進(jìn)行全細(xì)胞生物催化檢測(cè)谷氨酸含量的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)該研究通過(guò)構(gòu)建不同的表面展示系統(tǒng)探究了his-tag標(biāo)簽、不同表達(dá)載體和表達(dá)菌株對(duì)蛋白可溶性表面展示的影響，為實(shí)現(xiàn)表面展示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。外源蛋白和錨定蛋白的匹配是能否成功構(gòu)建表面展示系統(tǒng)的重要因素，本研究首先以來(lái)自于Bac

2、illus subtilis的谷氨酸脫氫酶基因?yàn)槟康幕?，以?lái)自于Pseudomona borealis的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定蛋白構(gòu)建了表達(dá)載體。結(jié)果證明融合蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中以包涵體形式表達(dá)，說(shuō)明目的蛋白沒(méi)有成功表面展示在大腸桿菌細(xì)胞表面。本研究接著以來(lái)自于菌株Thermococcus waiotapuensis的谷氨酸脫氫酶基因?yàn)槟康幕?，以冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定蛋白構(gòu)建了表達(dá)載體，結(jié)果表明谷氨酸脫氫酶成功展示在大腸桿菌細(xì)胞

3、表面，說(shuō)明冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域?qū)?lái)自于該菌的谷氨酸脫氫酶有很好的分泌展示功能。這是谷氨酸脫氫酶首次在大腸桿菌表面展示，為微生物表面展示技術(shù)應(yīng)用于生物傳感器、食品檢測(cè)、醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域提供了理論研究基礎(chǔ)和實(shí)際應(yīng)用生物材料。本研究主要獲得了以下幾個(gè)方面的研究成果:
　　1.B.subtilis中谷氨酸脫氫酶表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
　　首先以來(lái)自于B.subtilis的谷氨酸脫氫酶基因?yàn)槟康幕?，以冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定蛋白，分別構(gòu)建了

4、表達(dá)載體pET-Inp-gldh、pET-Inp-gldhT和pACY-Inp-gldh，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株。通過(guò)SDS-PAGE和酶活測(cè)定對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行了定位分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)，說(shuō)明來(lái)源于該菌的谷氨酸脫氫酶沒(méi)有展示到到大腸桿菌細(xì)胞表面。
　　該部分研究同時(shí)表明:來(lái)自于B.subtilis的谷氨酸脫氫酶基因的表達(dá)在有無(wú)his-tag標(biāo)簽表達(dá)的情況下均以包涵體形式被表達(dá);表達(dá)載體pET2

5、8a(+)和pACYCDuet-1對(duì)來(lái)自于該菌的谷氨酸脫氫酶的表達(dá)效果相同，都以包涵體形式表達(dá);質(zhì)粒pET-Inp-gldh和pACY-Inp-gldh轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Ecoli BL21(DE3)、E.coli transB(DE3)、E.coli transetta(DE3)、E.coli BL21(DE3) plys后，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白都為包涵體，說(shuō)明以上各表達(dá)菌株對(duì)來(lái)自于該菌的谷氨酸脫氫酶表達(dá)效果一致。
　　2.T.w

6、aiotapuensis中谷氨酸脫氫酶表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
　　以T.waiotapuensis中編碼谷氨酸脫氫酶的基因?yàn)槟康幕?，以冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定蛋白構(gòu)建了表達(dá)載體pTInaPb-N-Gldh，將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)后的菌株進(jìn)行SDS-PAGE電泳和酶活測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自于該菌的谷氨酸脫氫酶成功展示在大腸桿菌細(xì)胞表面。
　　本研究中測(cè)得谷氨酸脫氫酶展示菌株的全細(xì)胞酶活為3.12 U/O

7、D600，外膜組分酶活占全細(xì)胞酶活的90％;其反應(yīng)的最適溫度為70℃，最適pH為9.0。該融合蛋白在4℃條件下放置一個(gè)月之后，幾乎能保持100％的活性，具有很好的酶活穩(wěn)定性。過(guò)渡金屬離子能夠不同程度的抑制酶活，而常見(jiàn)金屬離子和陰離子對(duì)酶活幾乎沒(méi)有影響。該表面展示的谷氨酸脫氫酶能夠特異性催化L-谷氨酸，優(yōu)于目前已報(bào)道的其它谷氨酸脫氫酶;并且以NADP+為專一性輔酶，反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH能夠在340 nm處進(jìn)行光譜測(cè)定檢測(cè)得到。本研究以表面