基于高通量測序技術的藥用植物表達序列標簽系統的構建與應用.pdf

1、表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）技術是分離與克隆新基因、研究基因表達譜的有效方法。本研究利用EST分析方法，建立藥用植物轉錄組的研究方法體系，通過新一代高通量測序技術454 GS FLX Titanium獲得的ESTs，發(fā)掘藥用植物生物活性成分的合成相關的關鍵酶基因。本研究以甘草、丹參、蛇足石杉和龍骨馬尾杉為例，分析了高通量測序技術及轉錄組分析方法在藥用植物中的應用。
　　 甘草（Glycyr

2、rhiza uralensis Fisch.ex DC.）是世界上使用最為廣泛的藥用植物之一，被廣泛應用于食品和煙草添加劑。由于缺乏甘草的基因組和轉錄組數據，甘草酸生物合成途徑尚不明確。本研究應用高通量測序技術454 GS FLX Titanium對甘草的營養(yǎng)器官的轉錄組進行測序，構建EST文庫。獲得59219條EST序列，平均長度409 bp。將454測序所得EST與GenBank中50666條甘草EST進行合并拼接，獲得27229條

3、unigene（11694條contig，15535條singleton）。將這些unigene與公共數據庫（SwissProt，KEGG，TAIR Nr和Nt）進行比對注釋（閾值E≤1e-5），其中20229條序列獲得注釋，注釋結果大約包括10000獨立的轉錄本。甘草酸骨架合成共涉及18個酶，在對EST文庫的分析整理中獲得了其中的16個酶的候選基因。本研究還發(fā)現了125個細胞色素P450候選基因和172個糖基轉移酶候選基因。根據CYP

4、家族，125個細胞色素P450候選基因被分為32類；根據GO基因功能分類，172個糖基轉移酶候選基因被分為45類。最后根據Real-time PCR器官特異性表達分析，發(fā)現最有可能參加甘草酸合成的基因，包括3個細胞色素P450和6個糖基轉移酶。
　　 丹參[Salvia miltiorrhiza Bge.）為唇形科（Labiatae）鼠尾草屬常用中藥，以根和根莖入藥?，F代化學及藥理學研究表明丹參含有兩類生理活性物質：脂溶性的丹參

5、酮類化合物和水溶性的丹酚酸類化合物，目前丹參基因組學和轉錄組學的研究較少。本研究應用新一代高通量測序技術454 GS FLX Titanium對2年生丹參根的轉錄組進行測序，研究其基因表達譜，挖掘其功能基因。獲得46722表達序列標簽（express sequence tags，EST），序列平均長度414 bp，與Sanger測序的長度相當。所得序列與GenBank丹參EST合并拼接，獲得18235條unigene，其中，454高通量

6、測序發(fā)現了13980條新的unigene。數據庫中的序列同源性比較表明，其中73.0％（13308條）與其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。通過BLAST與GeneOntology分析獲得了可能參與丹參酮合成的序列27條（編碼15個關鍵酶），參與丹酚酸合成的序列29條（編碼11個關鍵酶），細胞色素P450序列70條，轉錄因子序列577條。
　　 石杉屬植物蛇足石杉（Huperzia serrata）和龍骨馬尾杉（Phlegm

7、ariuruscarinnatuas）均含有石松類生物堿-石杉堿甲。石杉堿甲是治療早老性癡呆癥新藥的主要成分，具有良好的應用前景。雖然石杉科藥用植物具有重要的藥用價值，但是對于其基因組和轉錄組的研究卻極為有限，嚴重制約了新藥的研發(fā)利用。在蛇足石杉和龍骨馬尾杉的454-EST數據中，分別獲得140930和79920條ESTs，拼接為36763和31812個轉錄本。其中，共注釋到115個蛇足石杉和98個龍骨馬尾杉的轉錄本與生物堿、萜類、黃酮

8、/類黃酮等化合物的生物合成相關。在蛇足石杉和龍骨馬尾杉中共同表達的CYP450s有63個，利用real-time PCR檢測了蛇足石杉中的編碼CYP450s的轉錄本在根和葉中的表達差異，發(fā)現有20個轉錄本是在葉中高豐度表達而在根中表達較低。這與石杉堿甲在蛇足石杉中的器官特異性分布即葉中含量最高、根中含量較低相一致。我們推測它們是參與石松堿生物合成的候選基因。此外，在蛇足石杉中發(fā)現2729個SSR位點，龍骨馬尾杉中發(fā)現1573個SSR位點

9、。
　　 454高通量測序技術作為藥用植物功能基因組研究的重要手段可在甘草、丹參、蛇足石杉和龍骨馬尾杉功能基因的發(fā)現中發(fā)揮重要作用。本研究獲得了重要藥用植物甘草、丹參、蛇足石杉和龍骨馬尾杉的大量ESTs，研究了它們的轉錄組信息，發(fā)現了許多可能參與次生代謝產物生物合成、調節(jié)植物生長發(fā)育及環(huán)境響應的基因。這將為鑒定參與有效成分生物合成的功能基因提供極為豐富的基因資源，近而為實現利用生物技術生產甘草酸、丹參酮、丹酚酸、石松堿奠定理論基