MICA介導DC與NK細胞相互作用的初步研究.pdf

1、NK細胞不僅直接殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞，還分泌細胞因子調節(jié)機體的獲得性免疫功能。樹突狀細胞(DC)是激活初始T細胞、啟動特異性免疫應答的重要抗原遞呈細胞。前期研究表明：NK細胞與樹突狀細胞(DC)之間的對話(crosstalk)不僅影響天然免疫功能，還對獲得性免疫的形成及發(fā)展有深遠的影響。DC激活NK細胞，并通過上調NK細胞的活性而增強其抗腫瘤作用。反之，活化的NK細胞促進DC成熟，并誘導Th0細胞向Th1方向發(fā)展，從而增強機體的

2、免疫防御和免疫監(jiān)視功能。MHCⅠ類相關分子A(Major histocompatibility complex classⅠ chain-relatedprotein A，MICA)，是NK細胞活化性受體NKG2D的配體，MICA與NKG2D結合后激活NK細胞，發(fā)揮其細胞毒活性和分泌IFN-γ等細胞因子。盡管單核細胞表面無MICA的表達，胞漿內卻存在MICA分子。因此，本文試圖研究MICA如何介導DC與NK細胞的相互作用，以及MICA參

3、與DC與NK細胞之間的對話是否與結腸癌的免疫逃逸有關，從而深入探討MICA參與腫瘤發(fā)病的機制。本研究分為三部分：
　　 第一部分：DC表達MICA對NK細胞活性的影響。
　　 目的：觀察單核細胞分化為DC時是否表達MICA，以及DC表達MICA后對NK細胞活性的影響。
　　 方法：首先分離正常個體和結腸癌患者外周血單個核細胞(PBMC)，經重組GM-CSF、IL-4誘導為未成熟DC(iDC)。然后分別用LPS、T

4、NF-α、CD40L、IL-15和IFN-α刺激成熟，流式細胞儀(FCM)檢測MICA在單核細胞、iDC以及成熟DC(mDC)細胞表面的表達。并觀察DC表達MICA后對NK細胞表達CD69、細胞毒活性和IFN-γ分泌的影響。最后分別利用重組NKG2D-Ig蛋白和IL-12抗體阻斷實驗觀察對DC激活NK細胞的影響。
　　 結果：健康個體和結腸癌患者單核細胞均微量表達MICA，iDC表面MICA表達量均提高。與iDC相比，LPS、T

5、NF-α和CD40L刺激的mDC表面MICA表達無明顯變化，但IFN-α、IL-15可刺激健康個體的成熟DC上調表達MICA，卻不能促進結腸癌患者的成熟DC上調MICA的表達。受IFN-α刺激成熟的DC促進NK細胞表達CD69、分泌IFN-γ、殺傷K562細胞。在DC激活NK細胞的培養(yǎng)體系中加入NKG2D-Ig蛋白可下調NK細胞毒活性和分泌IFN-γ，而加入IL-12抗體僅下調NK細胞分泌IFN-γ，對細胞毒功能無影響。
　　

6、結論：正常個體iDC和mDC細胞表面均表達MICA，IFN-α、IL-15刺激mDC上調MICA表達。DC表達MICA增強NK細NK活性，且其細胞毒活性的提高依賴于DC表面相關配體與NK細胞表面NKG2D的相互作用。結腸癌患者體內mDC低表達MICA可能是其免疫逃逸的機制之一。
　　 第二部分：受MICA刺激的NK細胞對DC活性的影響。
　　 目的：觀察固相MICA(iMICA)是否協(xié)同NK細胞對iDC的作用，以及受NK

7、細胞攻擊的MICA陽性靶細胞是否促進DC吞噬。
　　 方法：首先分別取異體新鮮分離的NK細胞、或受固相MICA刺激的異體NK細胞，以及IL-2、或IL-2聯(lián)合iMICA刺激的自體NK細胞與iDC按5∶1孵育，24小時后FCM分析CD86或HLA-DR陽性細胞頻率。其次取自體NK細胞以IL-2、或IL-2聯(lián)合iMICA刺激后按1∶5比例與iDC孵育，24小時后FCM檢測HLA-DR分子的表達變化，并通過IFN-γ抗體阻斷實驗觀察i

8、MICA刺激的NK細胞是否通過分泌IFN-γ促進DC成熟。最后分別將受LAK細胞攻擊的、或絲裂霉素C處理的CFSE標記的K562、K562-MICA細胞，與iDC作用24小時后FCM檢測HLA-DR與CFSE雙陽性細胞頻率。
　　 結果：當NK與iDC孵育比例為5∶1時，同種異體新鮮NK細胞及自體活化NK細胞均能殺傷iDC，而固相MICA無協(xié)同作用。當NK與iDC孵育比例為1∶5時，固相MICA協(xié)同自體NK細胞誘導iDC成熟，而

9、加入IFN-γ抗體可以下調DC表達HLA-DR。當K562、K562-MICA細胞受LAK細胞攻擊或絲裂霉素C處理后，K562-MICA細胞易被DC吞噬。
　　 結論：當IL-2活化的NK細胞殺傷iDC時，無需iMICA刺激。但固相MICA可以刺激NK細胞分泌IFN-γ促進DC成熟。MICA陽性的腫瘤細胞被NK細胞攻擊后促進iDC吞噬。
　　 第三部分：結腸癌患者外周血單核細胞MICA表達與NK細胞相關表型的關聯(lián)分析。<

10、br>　　 目的：比較結腸癌患者與健康個體外周血MICA表達的單核細胞頻率，以及NKG2D、CD16、CD69陽性NK細胞頻率的差異，并探討體內單核細胞MICA表達與NK活性相關受體的表達是否存在關聯(lián)。
　　 方法：取結腸癌患者以及健康個體外周血，常規(guī)分離PBMC，用不同顏色熒光單克隆抗體分別標記CD14/MICA，CD56/NKG2D，CD56/CD69，CD56/CD16，流式細胞儀分析雙陽性細胞頻率。利用直線相關回歸分析

11、單核細胞MICA表達頻率與NK表達NKG2D及CD69頻率的關聯(lián)性。
　　 結果：結腸癌患者與健康個體外周血CD14+/MICA+單核細胞頻率無明顯差異。結腸癌患者CD56+/NKG2D+細胞，CD56+/CD69+細胞頻率與健康個體相比明顯下調，但CD56+/CD16+細胞頻率無差異。另外，單核細胞MICA的表達與NK細胞NKG2D及CD69的表達無明顯關聯(lián)。
　　 結論：結腸癌患者與健康個體外周血MICA陽性的單核細