Hainanenins基因克隆，活性鑒定及誘導癌細胞凋亡的機制初探.pdf

1、腫瘤是全世界死亡率最高的重大惡性疾病之一，在治療過程中常常伴隨著腫瘤的多藥耐藥性MDR產生、降低機體免疫力，最終導致化療失敗?？朔[瘤MDR，提高藥物靶向性一直是腫瘤治療中的難點。近來，由生物基因組編碼的具有抵抗外源性微生物侵害、清除體內病變細胞活性的抗癌肽ACPs，被發(fā)現(xiàn)具有廣譜殺菌、抑病毒、抑殺腫瘤細胞等作用。由于其抗腫瘤活性顯著，分子量小，結構簡單，理化性質穩(wěn)定，不易產生耐藥性，以及對哺乳動物正常細胞毒性較低等特點，已經成為抗腫瘤

2、藥物研發(fā)的熱點。
　　本實驗中，以海南湍蛙(Amolops hainanensis)為研究對象，從其背皮分泌物中直接分離得到2種活性多肽。隨后利用分子生物學技術，通過構建背皮組織cDNA文庫，設計引物，擴增序列，最終從31個連接產物中得到10種多肽序列，通過序列比對發(fā)現(xiàn)這10種多肽分屬于4個家族，其中有5條高度同源的序列屬于一個新的家族，并且其中一條與分泌物中純化得到的多肽序列相同。根據(jù)物種種屬名稱，我們將這個家族命名為haina

3、nenins并以序號1～5分別命名5條多肽，他們成熟肽部分都是由21個氨基酸殘基組成，C末端由15位和21位的半胱氨酸連接成含有7個氨基酸殘基的二硫環(huán)。
　　我們選取hainanenin-1和hainanenin-5檢測了抗菌活性、抗氧化性、溶血性抑制抗腫瘤活性，結果顯示:Hainanenin-1和hainanenin-5對17種細菌都有明顯的抗菌活性，抗氧化性不明顯，溶血性相對較高;其中Hainanenin-1對5中癌細胞都有明

4、顯的抑制生長的活性，IC50值在10～13μM之間，對乳腺癌細胞MCF-7的IC50值低至6.9μM。而對人臍靜脈細胞HUVEC，抑制生長作用不明顯，在其他腫瘤細胞IC50濃度范圍內，可以認為對其生長無影響。掃描電鏡結果顯示，經hainanenin-1處理的MCF-7，細胞膜表面微絨毛斷裂，質地由粗糙變得光滑，細胞形狀由貼壁的梭形變成圓形，并且細胞膜發(fā)泡形成囊狀結構，并最終破裂，在膜上形成孔洞，破壞細胞膜的完整性;細胞早期凋亡時，細胞膜

5、上磷脂酰絲氨酸外翻，可與膜染料AnnexinⅤ-FITC結合，連同核酸染料PI進行雙染，檢測藥物處理后細胞的早期凋亡率，結果顯示IC50濃度的hainanenin-1處理細胞24h后，MCF-7細胞早期凋亡率達到62％; Hoechst33258染色結果顯示，hainanenin-1能夠引起染色體凝集細胞核皺縮;最后，通過檢測caspase-1，3，9的活化率發(fā)現(xiàn)，hainanenin-1能夠大量激活MCF-7細胞內caspase3和c