β-catenin轉染表皮干細胞對糖尿病大鼠創(chuàng)面修復的影響.pdf

1、目的:
　　探討體外培養(yǎng)條件下不同葡萄糖濃度對大鼠表皮干細胞( epidermal stem cells,ESCs)生長的影響,以及上調β-catenin的表達對糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)大鼠表皮干細胞增殖分化的作用,觀察上調糖尿病大鼠表皮干細胞中β-catenin的表達對創(chuàng)面愈合的影響,為臨床糖尿病創(chuàng)面的修復治療奠定實驗基礎。
　　方法:
　　(1)取SD大鼠背部皮膚,采用酶消化法分離表皮和

2、真皮,Ⅳ型膠原差速貼壁法純化表皮干細胞,建立體外培養(yǎng)大鼠表皮干細胞模型,隨機分成A組(對照組,葡萄糖濃度5.5mmol/L),B組(葡萄糖濃度10mmol/L),C組(葡萄糖濃度20mmol/L),D組(葡萄糖濃度40mmol/L)。顯微鏡下觀察表皮干細胞的生長情況,免疫細胞化學法檢測表皮干細胞中β-catenin、Wnt1的表達,使用圖像分析軟件測量陽性細胞表達的平均積分光密度值。
　　(2)制備糖尿病大鼠模型(腹腔一次性注射鏈

3、脲佐菌素STZ,劑量為65mg/kg),體外分離培養(yǎng)糖尿病大鼠表皮干細胞(ESCs),采用脂質體介導法將pcDNA3.1myc-β-catenin質粒轉入ESCs,同時設立脂質體對照組(轉脂質體)和正常對照組,48h后,免疫細胞化學法檢測各組表皮干細胞中β-catenin的表達;Western Blot檢測轉染組與正常對照組表皮干細胞中β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達情況。
　　(3)選取成模的DM大鼠15只,

4、分別在脊柱兩側的背部制備直徑約2.0cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面,即每只大鼠制備四個創(chuàng)面,并隨機分為4組:A組(創(chuàng)面移植羊膜負載轉染的表皮干細胞組),B組(創(chuàng)面移植羊膜負載未轉染表皮干細胞組), C組(羊膜組)和D組(空白對照組,不加任何干預)。觀察創(chuàng)面愈合情況并測算創(chuàng)面愈合率,采用HE染色進行組織病理學觀察以及免疫組織化學法檢測創(chuàng)面組織中增殖細胞核抗原(PCNA)的表達。
　　結果:
　　(1)顯微鏡下觀察,隨著葡萄糖濃度的升高

5、,細胞數(shù)量逐漸減少,生長速度緩慢,胞體透亮度下降,活力降低;免疫細胞化學染色分析結果顯示,C組β-catenin(0.079±0.007)、Wnt1(0.083±0.004)和D組β-catenin(0.068±0.008)、Wnt1(0.070±0.006)的表達均明顯低于A組(β-catenin:0.096±0.123;Wnt1:0.095±0.010),p<0.01。
　　(2)免疫細胞化學結果顯示,表皮干細胞轉染重組質粒后

6、β-catenin的表達增高,其表達水平高于脂質體組和空白對照組(p<0.01),脂質體組和空白對照組組間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。Western Blot檢測結果顯示,轉染組β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達均高于空白對照組(1.451±0.027vs1.094±0.026;1.084±0.078vs0.694±0.082;1.490±0.030vs0.807±0.019,p<0.01)。
　　(3)A

7、組創(chuàng)面與B、C、D組相比較,其愈合時間縮短且創(chuàng)面愈合率提高,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各組創(chuàng)面組織中均可見PCNA陽性細胞表達,A組的陽性細胞表達高于其他三組。
　　結論:
　　(1)本實驗條件下高濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)大鼠表皮干細胞的生長有抑制作用,且表皮干細胞中β-catenin、Wnt1的表達減弱。
　　(2)采用脂質體轉染法可成功將pcDNA3.1myc-β-catenin重組真核表達質粒轉入體外