丙戊酸誘導前列腺癌PC-3細胞自噬及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 前列腺癌是美國最常見的腫瘤，在癌癥引起的死亡中位居第二位。在前列腺癌的發(fā)病率一直較低的國家如中國，其發(fā)病率也呈快速上升趨勢。該病一旦診斷，其主要的治療方法為手術切除和放射治療，但這兩種方法對于晚期前列腺癌的治療效果均不佳，因此其長期生存率也是很低的。近年來，越來越多的文獻報道，組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitor,HDACI)可在體內外抑制腫瘤細胞的增殖，誘導分化和

2、凋亡。丙戊酸(Valproic acid，VPA)作為HDACI類藥物，可以誘導腫瘤細胞生長抑制、分化和凋亡，但關于VPA誘導前列腺癌細胞發(fā)生自噬性死亡的文獻報道較少，在本項研究中，我們擬就VPA誘導前列腺癌PC-3細胞系發(fā)生自噬性死亡的過程進行觀察，并對其作用機制進行初步探討，為臨床開發(fā)治療前列腺癌的新藥物提供理論依據及實驗基礎。
　　 目的：
　　 對VPA誘導前列腺癌PC-3細胞發(fā)生自噬性死亡的過程在體外進行觀察和

3、檢測，并初步探索自噬與Akt/mTOR信號轉導通路的關系，為深入研究VPA抑制前列腺癌細胞生長的作用機制提供進一步理論依據。
　　 材料與方法：
　　 將人前列腺癌PC-3細胞接種于96孔板中，5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，應用5.0mmol/L VPA進行干預，并設立對照組，作用24h、48h、96h后行CCK-8染色法檢測細胞生長情況。本實驗分為對照組和VPA5.0mmol/L組。于細胞對數生長期加入藥物VPA，分別培

4、養(yǎng)24h、48h及72h，收集制備標本后行透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構(包括自噬體和自噬溶酶體)。PC-3細胞接種于蓋玻片置于6孔板中，分組及培養(yǎng)時間同上，常規(guī)收集、固定細胞，加入一抗及帶FITC熒光標記的二抗制片，應用免疫熒光測定儀觀察細胞內熒光的數量及強度。常規(guī)細胞培養(yǎng)，分組及藥物作用濃度和時間同上，應用Western-blotting檢測經VPA處理后PC-3細胞內LC3-11、p-Akt蛋白的表達水平。
　　 結果：<

5、br>　　 經VPA處理后，人前列腺癌PC-3細胞系細胞增殖活性實驗組與對照組短期內差別不大，無明顯統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。透射電子顯微鏡觀察可見人前列腺癌PC-3細胞系細胞質內有大量自噬體和自噬溶酶體，實驗組自噬體的數量較對照組明顯增多，且隨VPA作用時間的延長自噬的水平逐漸增強，證明了VPA誘導人前列腺癌PC-3細胞自噬性死亡的存在。經綠色熒光FITC標記的自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ可以清楚顯示自噬在細胞中的分布，即可見LC3綠

6、色熒光呈點狀散在分布于細胞膜附近，而陰性對照組只有極弱的熒光。隨VPA作用時間的延長，人前列腺癌PC-3細胞系細胞自噬特異性相關蛋白LC3-11表達水平明顯升高，而p-Akt蛋白的表達水平則明顯降低，變化趨勢顯著，有明顯統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 結論：
　　 VPA作用人前列腺癌PC-3細胞4天，可誘導前列腺癌PC-3細胞發(fā)生自噬，其自噬的程度與藥物作用的時間呈正相關，其誘導列腺癌PC-3細胞發(fā)生自噬的機制與阻