長期飲酒對正常飲食和高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響及機制探討.pdf

1、背景： 胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病機制之一。隨著飲酒的日益普遍及生活方式的逐漸西方化，探討長期飲酒伴或不伴高脂飲食對胰島素敏感性的影響及機制就顯得愈發(fā)重要，因為相關(guān)的研究結(jié)果必將成為指導人們建立良好生活方式及預防飲食相關(guān)疾病的重要依據(jù)。 觀察正常飲食及高脂飲食條件下，長期飲酒對機體胰島素敏感性的影響及相關(guān)信號分子的變化；從體內(nèi)、體外實驗兩個層面，利用大鼠和人兩個種屬的成熟脂肪細胞，驗證大鼠和人脂肪組織中AMPK/MEF

2、2/GLUT4信號通路的存在，闡述了酒精影響胰島素敏感性的可能機制。 具體探討了以下問題： 1．體內(nèi)實驗： 1．1觀察長期飲酒對正常飲食和高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響。 1．2觀察長期飲酒對脂肪組織中AMPK、MEF2及GLUT4表達的影響。 1．3驗證活體大鼠脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號通路的存在。 2．體外實驗： 2．1觀察體內(nèi)主要游離脂肪酸--棕櫚酸存在或不

3、存在時，酒精對AMPK、MEF2及GLUT4表達的影響。 2．2驗證大鼠和人類成熟脂肪細胞中AMPK/MEF2/GLUT4信號通路的存在。 方法： 1．體內(nèi)實驗部分： 1．1觀察長期飲酒對胰島素敏感性及相關(guān)信號分子的影響。 1．1．1動物分組及喂養(yǎng)： 分組一：雄性Wistar大鼠36只，按體重隨機分為3組，每組12只，即對照組；大劑量飲酒組；小劑量飲酒組。酒精每日一次灌胃給予，喂養(yǎng)時間22

4、周。 分組二：雄性Wistar大鼠36只，按體重隨機分為3組，每組12只，即正常飲食組；高脂飲食組；高脂飲食加酒精組。酒精每日兩次灌胃給予，喂養(yǎng)時間22周。 1．1．2大鼠葡萄糖耐量及胰島素敏感性的評價：處死前3天行口服糖耐量試驗，分別測定空腹血糖及糖負荷后30、60、120分鐘血糖，計算糖耐量曲線下面積，用以評價葡萄糖耐量。處死前抽取空腹血，檢測空腹血糖、空腹胰島素，并計算HOMA-IR指數(shù)，用以評價機體水平胰島素敏感

5、性。 1．1．3血漿酒精濃度、血清脂聯(lián)素及游離脂肪酸的檢測：大鼠處死時留取空腹血，干化學法檢測血漿酒精濃度。酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清脂聯(lián)素及游離脂肪酸。 1．1．4酒精對脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號轉(zhuǎn)導通路的影響：分離附睪及腎周脂肪組織并稱重，用以觀察內(nèi)臟脂肪變化。RT-PCR檢測附睪脂肪組織中AMPK的催化亞基AMPKα1和α2、MEF2兩個亞型MEF2A和MEF2D以及GLUT4的mRNA水平。Wes

6、tern blot檢測總AMPKα、磷酸化AMPKα、MEF2以及GLUT4的蛋白表達。免疫熒光檢測GLUT4的蛋白水平。 1．2驗證大鼠脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號通路的存在。 2．體外實驗部分： 2．1成熟大鼠和人脂肪細胞的分離：取正常雄性Wistar大鼠的附睪脂肪組織及成年男性的大網(wǎng)膜脂肪組織，小心剔除可見血管，用1mg/ml的膠原酶Ⅰ進行消化，先后經(jīng)500μm、250μm尼龍篩過濾、800

7、g離心得到成熟脂肪細胞。 2．2細胞分組及處理：將細胞重懸后，種到10mm培養(yǎng)皿中，每皿細胞數(shù)為1×107。實驗分組如下： 分組一：N組，正常對照組；A組，1mM AICAR；C組，20μM compound C； A+C組，AICAR與compound C共培養(yǎng)。 分組二：N組，正常對照組；E1組，100mM酒精；A組，1mM AICAR；E1+A組，100mM酒精與AICAR共培養(yǎng)。 分組三：N組，正

8、常對照組；P組，0．4mM棕櫚酸；E2組，20mM酒精；P+E2組，棕櫚酸與20mM酒精共培養(yǎng)；C組，20μM compound C；E2+C組，20mM酒精與compound C共培養(yǎng)。 2．3 AMPKα、MEF2以及GLUT4的檢測：RT-PCR檢測脂肪細胞中GLUT4mRNA水平；Western blot檢測T-AMPKα、pAMPKα、MEF2以及GLUT4的蛋白表達。 結(jié)果： 1．觀察酒精對胰島素敏感

9、性和脂肪組織中AMPK、MEF2及GLUT4表達的影響。 1．1體內(nèi)實驗部分： 1．1．1血漿酒精濃度 每同一次小劑量灌酒，血漿酒精濃度為4．44±0．6mg/dl，每日一次大劑量灌酒，血漿酒精濃度為87±24．9mg/dl，而每日兩次大劑量灌酒，血漿酒精濃度則僅為10．84±4．4mg/dl，表明血漿酒精濃度除與攝入酒精的總劑量有關(guān)外，還與攝入酒精的頻率有關(guān)。結(jié)合血漿酒精濃度、以往的研究及本研究的結(jié)果，我們推測

10、每日一次小劑量灌酒可能模擬了不飲酒或少量飲酒的效應，而在日飲酒總量相同的情況下，每日一次灌酒可能模擬了大量飲酒的效應，而每日兩次則模擬了適量飲酒的效應。 1．1．2胰島素敏感性評價： 1．1．2在正常飲食情況下，酒精喂養(yǎng)22周后，與C組相比，H組和L組大鼠空腹血胰島素水平分別增加27．6-和13．1％，HOMA-IR指數(shù)分別增加32．3-和13．3％，表明長期大劑量和小劑量飲酒均可降低機體胰島素敏感性，大劑量飲酒對胰島素

11、敏感性的影響尤為明顯。 1．1．2．2在高脂飲食情況下，與N組相比，HF組大鼠空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)分別增加28．1-、28．3-和69．8％。而與HF組比較，增加適量酒精攝入使空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)分別下降了7．8-，19．7-和28．2％。上述結(jié)果表明，高脂飲食可以誘發(fā)機體胰島素抵抗，而長期適量飲酒能夠改善高脂誘導的胰島素抵抗。 1．1．3長期飲酒對大鼠脂肪組織中AMPK、MEF2

12、、GLUT4表達的影響 1．1．3．1在正常飲食情況下，長期大量和小量飲酒不影響AMPKα1和AMPKα2亞單位的mRNA水平，同時脂肪組織T-AMPKα的蛋白水平也沒有明顯改變，但H、L組大鼠脂肪組織中pAMPK的蛋白水平顯著降低，提示長期攝入乙醇可抑制AMPK活化。與pAMPK變化一致，MEF2及GLUT4的轉(zhuǎn)錄和翻譯也明顯受抑，由于AMPK是MEF2的上游分子，而MEF2又是GLUT4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因此，長期飲酒降低脂肪

13、組織中GLUT4表達的機制很可能是抑制了AMPK的活化，進而使MEF2的表達降低所致。 1．1．3．2長期高脂飲食降低大鼠脂肪組織中AMPK的活化，進而引起MEF2及GLUT4 mRNA及蛋白表達減少，而長期適量酒精攝入則可以減輕高脂飲食對AMPK活化及MEF2表達的損害，從而增加GLUT4表達。 1．2體外實驗部分 1．2．1為選擇酒精的最適體外作用濃度，我們觀察了酒精的量效關(guān)系，如下圖所示，20mM酒精使成熟

14、大鼠脂肪細胞中AMPK活化增加，而50、100、150mM酒精抑制AMPK活化，并且這種抑制作用隨劑量增加而增強。因此在第一部分實驗中我們選擇100mM來模擬大量飲酒的效應，第二部分中選擇了20mM來模擬適量飲酒的效應。 1．2．2大劑量酒精處理抑制AMPK活化，減少MEF及GLUT4表達：在離體大鼠和人類成熟脂肪細胞中，100mM酒精顯著降低AMPK活化及MEF2和GLUT4的表達。體外實驗結(jié)果證實，酒精可以直接抑制上述分子的

15、表達，而不是繼發(fā)于其他系統(tǒng)的損害。 1．2．3適量酒精處理減輕游離脂肪酸對AMPK、MEF2及GLUT4表達的抑制作用：用棕櫚酸處理離體大鼠成熟脂肪細胞后，細胞內(nèi)AMPK的活化水平、MEF2和GLUT4的表達均顯著降低，當與20mM的酒精共培養(yǎng)時，上述分子的表達得到改善，提示適當濃度的酒精可以部分抵消游離脂肪酸對AMPK、MEF2、GLUT4表達的損害。 2．驗證脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號通路的存在

16、 2．1體內(nèi)實驗 將AICAR注入大鼠體內(nèi)可顯著增加脂肪組織AMPK的活化，進而使MEF2及GLUT4表達增加，說明活化的AMPK可以正向調(diào)節(jié)MEF2的表達，從而使GLUT4轉(zhuǎn)錄增加，最終導致GLUT4蛋白表達的增加。 2．2體外實驗 在大鼠及人類成熟脂肪細胞中，AICAR激活AMPK后，使MEF2和GLUT4的表達顯著增加。然而，如果用AMPK阻斷劑--Compound C預處理上述細胞，則觀察不到AICA

17、R對MEF2及GLUT4的激活作用，提示在大鼠和人類的脂肪細胞中， MEF2和GLUT4確實受到AMPKα正向調(diào)節(jié)，即存在AMPKα/MEF2/GLUT4這一信號通路。 結(jié)論： 1、在大鼠和人類成熟脂肪細胞中存在AMPK/MEF2/GLUT4信號轉(zhuǎn)導通路，AMPK正向調(diào)節(jié)MEF2及GLUT4的表達。 2、在正常飲食情況下，長期小量及大量飲酒降低胰島素敏感性，脂肪組織中AMPK活化受抑，導致MEF2表達減少，引起G